血清尿素測(cè)定

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1、【目的】學(xué)習(xí)血清尿素(Urea)測(cè)定方法，了解其意義?！驹怼垦迥蛩兀║rea）是蛋白質(zhì)的正常代謝產(chǎn)物。它的測(cè)定是常用的衡量腎小球功能的指標(biāo)之一。腎性血清尿素含量增加，提示腎小球損傷。是研究藥物腎毒性的重要指標(biāo)之一?！酒鞑摹客霉潭?、注射器、燒杯、可見分光光度計(jì)、試管、水浴【藥品】0.5%氯化高汞溶液、生理鹽水【動(dòng)物】家兔2只【方法】取家兔2只，1只注射氯化高汞5ml/kg（0.5%氯化高汞溶液1.0ml/kg)，另1只注射等量的生理鹽水。48小時(shí)后，從家兔耳靜脈取血1ml，制取血清，按血清尿素測(cè)定方法測(cè)定血清尿素含量?！窘Y(jié)果】記錄2只家兔血清尿素含量，比較并分

2、析其差別。附?血清尿素(Urea)測(cè)定方法【原理】尿素與二乙酰在酸性反應(yīng)環(huán)境中加熱，縮合生成色素原二嗪化合物。因二乙酰不穩(wěn)定，不宜直接加入，可由化學(xué)反應(yīng)生成。通常由反應(yīng)系統(tǒng)中二乙酰一肟與強(qiáng)酸作用，產(chǎn)生乙二酰。二乙酰和尿素反應(yīng)，縮合生成紅色的二嗪。根據(jù)顏色深淺確定尿素含量的多少?！驹噭?1)酸性試劑：在三角燒瓶中加蒸餾水約100ml，然后加入濃硫酸44ml及85%磷酸66ml。冷至室溫，加入硫氨脲50mg及硫酸鎘(CdSO4·8H2O)2g。溶解后用蒸餾水稀釋至1L，置棕色瓶中冰箱保存，可穩(wěn)定6個(gè)月。(2)二乙酰-肟溶液：稱取二乙酰-肟20g，加蒸餾水約900ml

3、，溶解后，再用蒸餾水稀釋至1L，置棕色瓶中，貯放冰箱內(nèi)可保存半年。(3)尿素標(biāo)準(zhǔn)貯存液（100mmol/L）:稱取干燥純尿素(MW=60.06)0.6g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至100ml，加0.1g疊氮鈉防腐，置冰箱內(nèi)可穩(wěn)定半年。(4)尿素標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)用液(5mmol/L)：取5.0ml貯存液用無氨蒸餾水稀釋至100ml.【操作】按表T4-1進(jìn)行混勻后，置沸水中加熱12分鐘，置冷水中冷卻5分鐘后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm，以空白管調(diào)至零點(diǎn)。比色讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管的吸光度。【計(jì)算】【正常參考值】2.86~8.20mmol/L尿素【注意事項(xiàng)】1．本法線性范圍達(dá)14m

4、mol/L尿素，如遇高于此濃度的標(biāo)本必須用生理鹽水作適當(dāng)?shù)南♂尯笾販y(cè)，然后乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。2．試劑中加入硫氨脲和鎘離子，增進(jìn)顯色強(qiáng)度和色澤穩(wěn)定性，但仍有輕度退色現(xiàn)象(每小時(shí)小于5%)。加熱顯色冷卻后應(yīng)及時(shí)比色。3．吸管必須校正，使用時(shí)務(wù)必注意清潔干凈，加量務(wù)必準(zhǔn)確。4．世界衛(wèi)生組織推薦用mmol/L尿素表示濃度，不再使用尿素氮一詞。5．血清尿素增高的病理因素常見于腎臟原因，腎臟原因又可分為腎性、腎前或腎后：①腎性：急性腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎及中毒性腎炎都可見血液中尿素含量增高。②腎前或腎后：引起尿量顯著減少或尿閉，如脫水、水腫、腹水、循

5、環(huán)功能衰竭、尿路結(jié)石或前列腺腫大引起的尿路梗阻等均可引起血清尿素含量升高。此外，生理因素也可導(dǎo)致血清尿素增高。如體內(nèi)蛋白質(zhì)分解過多：急性傳染病、上消化道出血、大面積燒傷、大手術(shù)后和甲狀腺功能抗進(jìn)等。雖然血清尿素增高，此時(shí)其它腎功能試驗(yàn)結(jié)果一般均正常。（注：本法引自中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編著的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》）尿素的測(cè)定方法可分為兩大類：一類直接法，尿素直接和某試劑作用，測(cè)定其產(chǎn)物，最常見的為二乙酰一肟法；另一類是尿素酶法，用尿素酶將尿素變成氨，然后用不同的方法測(cè)定氨?！　?)尿素酶法（直接法）：尿素酶法利用尿素酶催化尿素水解生成銨鹽，銨鹽可用納氏試劑直

6、接顯色、酚-次氯酸鹽顯色或酶偶聯(lián)反應(yīng)顯色。　　尿素測(cè)定目前多采用尿素酶偶聯(lián)法：用尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下使NADH氧化為NAD+時(shí)，通過340nm吸光度的降低值可計(jì)算出尿素含量?！　〈朔磻?yīng)是目前自動(dòng)生化分析儀上常用的測(cè)定原理。此外，尿素酶水解尿素產(chǎn)生氨的速率，也可用電導(dǎo)的方法進(jìn)行測(cè)定，其電導(dǎo)的增加與氨離子濃度有關(guān)，反應(yīng)只需要很短的時(shí)間，適用于自動(dòng)分析儀。　　2）酚-次氯酸鹽顯色法：尿素酶水解尿素生成氨和酚及次氯酸鹽，在堿性環(huán)境中作用形成對(duì)-醌氯亞胺，亞硝基鐵氰化鈉催化此反應(yīng)：　　對(duì)-醌氯亞胺同另一分子的酚作用，形成吲哚酚，它在堿性溶液中產(chǎn)生藍(lán)

7、色的解離型吲哚酚：　　此反應(yīng)敏感，血清用量少（10μl），無需蛋白沉淀，一般用于手工操作測(cè)定中?！　?)納氏試劑顯色法：尿素經(jīng)尿素酶作用后生成氨，氨可與納氏試劑（HgI2.2KI的強(qiáng)堿溶液）作用，生成棕黃色的碘化雙汞銨?！　∧蛩孛阜ǖ膬?yōu)點(diǎn)是反應(yīng)專一，特異性強(qiáng)，不受尿素類似物的影響，缺點(diǎn)是操作費(fèi)時(shí)，且受體液中氨的影響?！　、贫阴Ｒ浑糠ǎㄖ苯臃ǎ耗蛩乜膳c二乙酰作用，在強(qiáng)酸加熱的條件下，生成粉紅色的二嗪化合物（Fearom反應(yīng)），在540nm比色，其顏色強(qiáng)度與尿素含量成正比。二乙酰不穩(wěn)定，用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰?！　≡噭┲屑尤隖e3+或Cd2+及硫氨

8、脲，可提高