巨自噬檢測方法的研究進(jìn)展

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1、巨自噬檢測方法的研究進(jìn)展劉志友1鄒臘梅2楊思進(jìn)（指導(dǎo)）白雪3（1、2瀘州醫(yī)學(xué)院四川瀘州646000;3瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院四川瀘州646000）【摘要】細(xì)胞自噬（Autophagy}"是近十年來繼"細(xì)胞凋亡（Apoptosis）之后，當(dāng)前研宄之熱門［1］，木文將對近年來細(xì)胞巨自噬的檢測方法進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】自噬檢測自噬體Ic3beclinel【中圖分類號1R329.2【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】2095-1752（2012）02-0048-01細(xì)胞自噬是一個多階段、多基因參與調(diào)控的細(xì)胞生理過程［2］。是細(xì)胞通過自身形成的自噬囊泡，吞噬胞漿內(nèi)變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，

2、通過微管相關(guān)蛋白,以動力依賴性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解的過程,它有別于壞死，也不同于凋亡（三者均為細(xì)胞蛋白降解的途徑）。自噬囊胞由雙層被膜覆蓋，其起源目前并不清楚。根據(jù)發(fā)生自噬的機(jī)制不同，哺乳動物細(xì)胞自噬主要?dú)掷ň拮允?，小自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬。自噬囊胞內(nèi)容物被其所氈裹的膜性結(jié)構(gòu)帶至溶酶體后，均發(fā)生膜的迅速降解，進(jìn)而釋放出其中的底物，使溶酶體中水解酶對底物進(jìn)行有效水解，保證了細(xì)胞對底物的再利用。通過自噬性細(xì)胞死亡，組織實(shí)現(xiàn)對自身細(xì)胞周期的精密調(diào)節(jié)，對自身生長發(fā)育起重要作用［3］。研究細(xì)胞自噬（Autophagy）成為近

3、?年來繼細(xì)胞凋亡（Apoptosis）之后當(dāng)前

4、研究之熱門，木文將對細(xì)胞巨自噬的檢測方法進(jìn)行綜述。1自噬形成的穩(wěn)態(tài)監(jiān)測1.1Phagophore、autophagosome（自噬體）及autolysosome（自噬溶酶體）數(shù)量細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號后，在胞漿的某處形成一個小的類似“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴(kuò)張，扁平狀，就像一個由兩層脂雙層組成的碗，稱為“Phag叩hore”，是自噬發(fā)生的鐵證之一。屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，需在透射電鏡下觀察（透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)檢測為檢測自噬體的金指標(biāo)）。其特征為新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢?！癙hagophore”不斷延伸，將胞漿中的

5、任何成分，包括細(xì)胞器，全部攬入“碗”中，然后“收口”，成為密閉的球狀的“autophagosome（自噬體）”。電鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的鐵證之二。自噬體的檢測對研究自噬尤為重要，而對其特征，專家們冇不同的意見［4】，但為雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)（比如饑餓誘導(dǎo)的自噬），內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等［5］。自噬體形成后，可與細(xì)胞內(nèi)吞的吞噬泡、吞飲池和內(nèi)體融合，自噬體與溶酶體融合形成“autolysosome（自噬溶酶體）”，其特點(diǎn)為單層膜，胞漿成分己降解。期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，兩者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的“貨物”也被降解，產(chǎn)物（氨基酸、

6、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中。1.2自噬體膜標(biāo)志性蛋白質(zhì)的檢測1.2.1LC3-II蛋白水平自噬的形成過程主要依賴自噬相關(guān)基因（autophagy-relatedgene,atg）和微管相關(guān)蛋白-3（LC-3）兩條途徑形成，其中以atgl2為主的atg系統(tǒng)主要參與前自噬泡形成，LC-3系統(tǒng)主要參與自噬泡修飾。其中LC-3正常情況下主要存于胞漿中，叫LC-3I，在自噬發(fā)生過程中，LC-3I通過自身修飾而截短與自噬泡膜結(jié)合。由于LC-3I和LC-3II分子量上的差異性，可在免疫印跡雜交中形成兩條不同條帶，通過觀察LC-3

7、I和LC-3II比值的變化以評價(jià)自噬形成：自噬形成吋，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II）,因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。冋吋檢測人類atg-6（又叫beclin-1）也是一種常用的自噬觀測手段［6】。1.2.2LC3（或Atg8）斑點(diǎn)自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)有Apgl2-Apg5結(jié)合體和微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（LC3）。Apgl2和Apg5在翻譯后就像單個分子一樣共價(jià)結(jié)合在一起，它定位在自噬體雙層隔離膜的整個延長階段。LC3是酵母菌自噬基因（Apg7/Apg8）［7］在哺乳動物中的同源物，和

8、前者相比，LC3除了定位在自噬體分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結(jié)合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內(nèi)外膜上，在自噬溶酶體膜上可見，通過與綠色熒光蛋白(GFP)結(jié)合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP,即可實(shí)現(xiàn)對自噬體的定量檢測［8］。由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測(Monitoring)自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成［9】。無自噬吋，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成吋，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明

9、亮的綠色熒