細(xì)胞自噬檢測(cè)

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1、2.5細(xì)胞裂解細(xì)胞從培養(yǎng)皿上被刮下來(lái)之后，在15ml滅菌塑料試管中用PBS洗滌3次，每次洗滌用10mlPBs充分重懸細(xì)胞，在4“c下5009離心5min。所有操作在冰上進(jìn)行。最后一步洗滌把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.smlePpendorf管中。把細(xì)胞充分重懸在TAP細(xì)胞裂解液中。根據(jù)細(xì)胞量決定裂解緩沖液的體積(一般每10川細(xì)胞用100川一200川TAPBu價(jià)r)。放置于冰上30min，每10min用移液槍吹打細(xì)胞一次使之充分懸浮。在4OC下用100009高速離心15min，把上清轉(zhuǎn)移到新的試管中進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，丟棄沉淀。2.13細(xì)胞自噬活性的檢測(cè)我們主要通過兩條途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，一饑餓處理

2、，二藥物RaPamycin處理。對(duì)于饑餓處理，吸去正常培養(yǎng)的細(xì)胞中的培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌細(xì)胞三次，注意不要使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，加入15mlEBss(用量根據(jù)培養(yǎng)皿的大小而定)連同2林M的ED64和pePstatin。在37“C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2一4h。對(duì)于RaPamycin處理，在普通細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培養(yǎng)12h。細(xì)胞自噬活性的檢測(cè)主要有兩條途徑，一條是通過轉(zhuǎn)染GFP一LC3，再用熒光顯微鏡觀察LC3在細(xì)胞質(zhì)中的聚集。二是用westemblotting和LC3的抗體，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源LC3n的增加。對(duì)于熒光顯微鏡分析，在U20S細(xì)胞

3、中轉(zhuǎn)染GFP一LC3，24h之后，把細(xì)胞繼代培養(yǎng)在有蓋玻片的6孔板中，誘導(dǎo)自噬，吸去培養(yǎng)液，用PBS小心潤(rùn)洗玻片1次，在每個(gè)孔內(nèi)加入3%的多聚甲醛，在室溫下閉光搖晃培養(yǎng)玻片20min。用PBS洗滌玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室溫下?lián)u晃10min，用固定液把蓋玻片固定在載玻片上，在室溫下干燥1min之后用熒光顯微鏡觀察。對(duì)于westemblotting，從培養(yǎng)皿上收集藥物或饑餓處理之后的細(xì)胞，加入1‘SDS蛋白上樣緩沖液，并用超聲波處理直到不粘稠為止，95“e煮沸樣品5min，室溫下高速(100009)離心5min，通過SDs一pAGE并用LC3的抗體(sigma)進(jìn)行weste

4、mblotting檢測(cè)，自噬活性越高的細(xì)胞內(nèi)LC3n的條帶濃度越高?！?.2.1自噬體檢測(cè)　　實(shí)驗(yàn)分為3組,分別為自噬誘導(dǎo)組,自噬抑制組和雷帕霉素組。自噬誘導(dǎo)組:1×105RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入50nmol/L雷帕霉素作用3h,然后按感染復(fù)數(shù)（MOI）=1∶10比例加入1×109CFU/L的H37Rv菌株培養(yǎng)3h,PBS（pH7.4）緩沖液洗脫3次以洗脫未結(jié)合的H37Rv菌株。自噬抑制組:RAW264.7細(xì)胞加入自噬抑制劑3MA（600mg/L）作用36h,然后按MOI=1∶10比例接種H37Rv菌株作用3h。雷帕霉素組:RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入

5、50nmol/L雷帕霉素作用3h。上述各組細(xì)胞胰酶消化后收集,20g/L鋨酸固定過夜,透射電鏡觀察自噬體的形成?！　?.2.2菌落形成單位（CFU）檢測(cè)　　自噬誘導(dǎo)組和自噬抑制組細(xì)胞胰酶消化后收集,加入2倍體積雙蒸水裂解細(xì)胞,7000r/min離心,收集沉淀,重懸后1∶107稀釋,取100μL懸液接種于7H10培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)21d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)?！?結(jié)果　　2.1自噬體檢測(cè)　　雷帕霉素作用于RAW264.7細(xì)胞后,以H37Rv菌株感染細(xì)胞,透射電鏡可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中有大量由單層膜組成的自噬囊泡出現(xiàn),同樣雷帕霉素組也可誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬體形成。而以自噬抑制劑3MA處理RAW264.7后,細(xì)胞中

6、未發(fā)現(xiàn)自噬囊泡（圖1）?！　?.2CFU檢測(cè)　　H37Rv菌株感染細(xì)胞后裂解,稀釋后接種于7H10培養(yǎng)基,經(jīng)過21d培養(yǎng),計(jì)數(shù)CFU。自噬誘導(dǎo)組H37Rv菌株CFU為4.12±0.32,而3MA處理后CFU為6.43±0.11,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明自噬體產(chǎn)生后可對(duì)胞內(nèi)感染的H37Rv菌株有一定的清除作用。1．3免疫熒光法觀察長(zhǎng)春瑞濱給藥后A549細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白表達(dá)的變化A549細(xì)胞接種于多聚賴氨酸處理的蓋玻片于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入一定濃度的長(zhǎng)春瑞濱同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照，培養(yǎng)不同時(shí)間(O一24)h后，于蓋玻片上4％多聚甲醛固定細(xì)胞15min，

7、固定的細(xì)胞用PBS洗兩次后，加入0．25％Triton—X100冰上放置5min，PBS洗2次，然后加入1％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)處理30min，加入I％BSA稀釋的羊抗人MAPl一LC3一II(1：200)，4oC孵育過夜，次日用PBS洗3次后，加)LFITC標(biāo)記的兔抗羊IgG(1％BSA以l：20的比例稀釋)，室溫下避光孵育30min，PBS再次洗滌細(xì)胞后，用lO¨g／mLPI和RnaseA室溫下細(xì)胞核DNA染色3