人白介素12植物表達(dá)載體的構(gòu)建論文

《人白介素12植物表達(dá)載體的構(gòu)建論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。

1、人白介素12植物表達(dá)載體的構(gòu)建論文【摘要】目的：構(gòu)建人白介素12(hIL12)基因的植物表達(dá)載體.方法：采用PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCA13hIL12中擴(kuò)增hIL12基因，SmaI，SacI分別酶切hIL12基因和植物表達(dá)載體pBI121，回收，T4DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒pBI121hIL12，雙酶切和DNA測(cè)序鑒定后，通過(guò)三親雜交法將表達(dá)載體pBI121hIL12分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105和GV3101，用PCR法進(jìn)行鑒定.結(jié)果：雙酶切及DNA序列測(cè)定證實(shí)hIL12已插入到表達(dá)載體pBI121中.freelaI

2、，SacI），T4DNA連接酶（美國(guó)Promega公司）；高保真即用PCR擴(kuò)增試劑盒、UNTQ10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）；化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1hIL12引物的設(shè)計(jì)上游引物參考GenBank中cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司完成，即5′TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA3′，其中CCCGGG為SmaI酶切位點(diǎn)；下游引物5′ACCGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG3′，其中GAGCTC為SacI酶切位點(diǎn).1.2.2PCR擴(kuò)增hIL1

3、2基因在0.2mLEppendorf管中加入上、下游引物各3μL，模板pCA13hIL121μL，2×PCRMaster25μL，補(bǔ)去離子水至50μL.擴(kuò)增條件為94℃10min，94℃1min，64℃1min，72℃2.5min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，將1600bp左右的目的片段回收純化.1.2.3重組質(zhì)粒pBI121hIL12的構(gòu)建和鑒定PCR產(chǎn)物純化回收后與載體pBI121經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（SmaI，SacI）雙酶切，取回收的PCR產(chǎn)物和載體大片段以濃度比3∶1，16℃

4、連接過(guò)夜.轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，涂布于100mg/L卡那霉素抗性瓊脂平板，挑選陽(yáng)性克隆，堿裂解法小量提取重組質(zhì)粒，作SmaI，SacI雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序鑒定［3］.構(gòu)建的重組載體見(jiàn)圖1，其中hIL12由P35，P40兩亞基的基因經(jīng)Linker序列連接得到.圖1表達(dá)載體pBI121hIL12示意圖1.2.4pBI121hIL12轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌采用三親雜交法：受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌分別于3mL含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜（受體菌，28℃；其余兩種37℃過(guò)夜培養(yǎng)），按1∶1∶1的比例混合后，取50μ

5、L涂布在無(wú)抗生素的LB平板上，28℃，過(guò)夜培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后涂布相應(yīng)的選擇平板（含50mg/L卡那霉素、100mg/L利福平、50mg/L鏈霉素），待長(zhǎng)出后，挑單菌落重新在相應(yīng)的選擇平板上進(jìn)行純化，挑出純化后的單個(gè)菌落在相應(yīng)抗性LB液體培養(yǎng)基中28℃，過(guò)夜培養(yǎng)，用于鑒定.1.2.5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR鑒定采用文獻(xiàn)［4］的方法分別提取農(nóng)桿菌（EHA105，GV3101）中的miniTi質(zhì)粒，用預(yù)先設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，獲得可用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌.2結(jié)果2.1PCR方法獲取hIL12基因片段以質(zhì)粒pCA13hIL12為模板，運(yùn)用P

6、CR方法獲得全長(zhǎng)hIL12基因（1613bp，圖2）.2.2重組質(zhì)粒pBI121hIL12的鑒定經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI，SacI酶切后得到大小約1600bp和12800bp的大片段，表明hIL12已經(jīng)克隆到質(zhì)粒pBI121中（圖3）.質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序鑒定，通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，目的基因與GenBank中已發(fā)表的基因序列完全一致，表明植物表達(dá)載體pBI121hIL12構(gòu)建成功.2.3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR檢測(cè)從三親融合后的農(nóng)桿菌中提取miniTi質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小約1600bp的片段，與來(lái)自大腸桿

7、菌DH5α中的重組質(zhì)粒pBI121hIL12為模板的PCR產(chǎn)物一致，而對(duì)照空載根癌農(nóng)桿菌單菌落為空白，表明獲得了2種含hIL12基因的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌（圖5）.3討論hIL12是相對(duì)分子質(zhì)量為75ku的蛋白質(zhì)，由不同基因編碼的2個(gè)亞基P35與P40兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的異二聚體，研究表明，細(xì)胞必須同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)基因才能產(chǎn)生有活性的IL12.我們選用的質(zhì)粒pCA13hIL12中的hIL12基因就是利用這兩個(gè)亞基具有獨(dú)立的基因序列特點(diǎn)，將hIL12兩個(gè)亞單位進(jìn)行融合，中間插入一個(gè)Linker序列，以保證其基因產(chǎn)物具

8、有正確的蛋白結(jié)構(gòu)及等比例的表達(dá).實(shí)驗(yàn)中選用的載體pBI121是一個(gè)常用的植物表達(dá)載體，多克隆位點(diǎn)上游帶有CaMV35S啟動(dòng)子，在植物組織中能啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，下游帶有GUS報(bào)告