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《白介素12重組腺病毒載體的構(gòu)建及其抗腫瘤作用初步觀察論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、白介素12重組腺病毒載體的構(gòu)建及其抗腫瘤作用初步觀察論文鞠全榮黃麗華張孝衛(wèi)杜德田耿秀蘭劉宗印馬力張如勝任東俊【摘要】［目的］構(gòu)建攜帶小鼠白細(xì)胞介素12腺病毒載體（AdCMVmIL,12），并觀察其對(duì)H22腫瘤的抑瘤效果。［方法］構(gòu)建重組質(zhì)粒pdlE1SP1BmIL,12，并用該質(zhì)粒與質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后包裝而成AdCMVmIL,12，并進(jìn)行酶切法鑒定。同時(shí)制備腫瘤動(dòng)物，通過腫瘤內(nèi)局部注射AdCMVmIL,12，觀察其抗腫瘤作用。［結(jié)果］酶切鑒定顯示構(gòu)建正確，其病毒滴度為1.3×109pfu/ml；當(dāng)病毒滴度為100MOI時(shí)，mIL,
2、12濃度達(dá)到3417ng/1×106細(xì)胞/24h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明.freelIL,12的小鼠，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P0.01），生存期顯著延長。［結(jié)論］構(gòu)建AdCMVmIL,12成功，腫瘤內(nèi)局部注射可發(fā)揮抗腫瘤作用?！娟P(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素12重組腺病毒基因表達(dá)腫瘤小鼠1材料與方法1.1材料與試劑菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pCDNA/amp/mIL,12/p35，pCDNA/amp/mIL,12/p40，pCA13，pdlE1SP1B，pJM17，大鼠髓質(zhì)甲狀腺癌細(xì)胞（rMTC）由美國芝加哥大學(xué)提供；人胚腎293細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)
3、提供；T4DNA連接酶（Invitrogen），限制性內(nèi)切酶HindⅢ,Xhol,EcoRⅤ，BglⅡ(TaKaRa)，RNA酶抑制劑（北京華美公司）；昆明種小鼠購自山東大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXY（魯）20030004；H22由本室保存。1.2方法1.2.1質(zhì)粒制備用感受態(tài)大腸桿菌DH5α常規(guī)方法擴(kuò)增質(zhì)粒pCDNA/amp/mIL,12/p35、pCDNA/amp/mIL,.freelIL,12的構(gòu)建：用HindⅢ、Xhol酶切pCDNA/amp/mIL,12/p40，并將其插入HindⅢ、Xhol酶切后的pCA13中，獲得pCA13mI
4、L,12/p40；同法用HindⅢ和EcoRⅤ酶切pCDNA/amp/mIL,12/p35，并將其插入HindⅢ、EcoRⅤ酶切后的pCA13中，獲得pCA13mIL,12/p35；將BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p40并補(bǔ)平粘端所得小片段與EcoR1酶切pdlE1SP1B并補(bǔ)平粘端所得大片段通過T4DNA連接酶連接，得到pdlE1SP1BmIL,12/p40；將BglⅡ酶切pdlE1SP1BmIL,12/p40所得大片段和BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p35所得小片段連接，得到pdlE1SP1BmIL,12。重組的pdlE1SP1
5、BmIL,12/p40/p35分別含有兩個(gè)CMV啟動(dòng)子和兩個(gè)SV40終止信號(hào)。用pdlE1SP1BmIL,12轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增出AdCMVmIL,12。包裝過程：在1ml無血清培養(yǎng)基中加入5μl脂質(zhì)體（LIPOFECTAMINE）、8μgpJM17及4μgpE1SP1BmIL,12，上述混合液室溫放置15min。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗兩遍，加入上述混合液，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育3~4h，再加入含20%胎牛血清的DMEM，CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。第二天將細(xì)胞分至3個(gè)培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補(bǔ)充0.5ml含10%胎
6、牛血清的DMEM，注意觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)。包裝好的腺病毒為AdCMVmIL,12。轉(zhuǎn)染前正常293細(xì)胞呈梭狀，連接成片。轉(zhuǎn)染后293細(xì)胞固縮成團(tuán)、部分細(xì)胞裂解。1.2.2對(duì)重組腺病毒鑒定用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Xhol對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行常規(guī)酶切鑒定。1.2.3重組腺病毒的擴(kuò)增和滴度測(cè)定取經(jīng)酶切鑒定正確的AdCMVmIL,12感染293細(xì)胞，大量擴(kuò)增AdCMVmIL,12。將擴(kuò)增后的病毒液做倍比稀釋，在96孔板上感染293細(xì)胞進(jìn)行病毒滴定，觀察每孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。以出現(xiàn)CPE的最高稀釋度為病毒滴度。1.2.4AdC
7、MVmIL,12的生物學(xué)活性檢測(cè)取1×106大鼠髓質(zhì)甲狀腺癌細(xì)胞（rMTC），用500μl滴度為100MOI（感染復(fù)數(shù)）的AdCMVmIL,12感染1h，被感染的細(xì)胞經(jīng)過無血清培養(yǎng)基洗3遍后在96孔板上培養(yǎng)。24h后收集上清（內(nèi)含mIL,12）待檢測(cè)。同時(shí)用重組mIL,12作為陽性對(duì)照，用含有熒光素基因重組腺病毒（AdCMVLuc）感染后的rMTC培養(yǎng)上清作陰性對(duì)照。1.2.5AdCMVmIL,12抑瘤性實(shí)驗(yàn)注射1×106個(gè)H22細(xì)胞于昆明種小鼠皮下，并在長成的瘤體內(nèi)分別注射AdCMVLuc和AdCMVmIL,12（含1×109pfu）稀釋液。
8、注射當(dāng)天為0天，每隔1天觀察1次腫瘤生長情況，并用卡尺測(cè)量腫瘤最小直徑（a）和最大直徑（b），按照公式（V=a2·b/2）計(jì)算腫瘤體積。觀察AdCMV
