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《白介素12重組腺病毒載體的構建及其抗腫瘤作用初步觀察》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、白介素12重組腺病毒載體的構建及其抗腫瘤作用初步觀察：鞠全榮 黃麗華 張孝衛(wèi) 杜德田 耿秀蘭 劉宗印 馬力 張如勝 任東俊【摘要】 ?。勰康模輼嫿〝y帶小鼠白細胞介素12腺病毒載體（AdCMVmIL,12），并觀察其對H22腫瘤的抑瘤效果。［方法］構建重組質(zhì)粒pdlE1SP1BmIL,12，并用該質(zhì)粒與質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染293細胞后包裝而成AdCMVmIL,12，并進行酶切法鑒定。同時制備腫瘤動物，通過腫瘤內(nèi)局部注射AdCMVmIL,12，觀察其抗腫瘤作用。［結(jié)果］酶切鑒定顯示構建正確，其病毒滴度為1.3×109pfu/ml；當病毒滴度為
2、100MOI時，mIL,12濃度達到3417ng/1×106細胞/24h。動物實驗表明，注射AdCMVmIL,12的小鼠，腫瘤體積明顯小于對照組（P<0.01），生存期顯著延長。［結(jié)論］構建AdCMVmIL,12成功，腫瘤內(nèi)局部注射可發(fā)揮抗腫瘤作用?！娟P鍵詞】白細胞介素12 重組腺病毒 基因表達 腫瘤 小鼠 1材料與方法1.1材料與試劑菌株、細胞株和質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pCDNA/amp/mIL,12/p35，pCDNA/amp/mIL,12/p40，pCA13，pdlE1SP1B，pJM17，大鼠髓質(zhì)甲狀腺癌細胞（rMT
3、C）由美國芝加哥大學提供；人胚腎293細胞由第二軍醫(yī)大學提供；T4DNA連接酶（Invitrogen），限制性內(nèi)切酶HindⅢ,Xhol,EcoRⅤ，BglⅡ(TaKaRa)，RNA酶抑制劑（北京華美公司）；昆明種小鼠購自山東大學動物中心，許可證號為SCXY（魯）20030004；H22由本室保存。1.2方法1.2.1質(zhì)粒制備用感受態(tài)大腸桿菌DH5α常規(guī)方法擴增質(zhì)粒pCDNA/amp/mIL,12/p35、pCDNA/amp/mIL,12/p40、pCA13、pdlE1SP1B、pJM17。AdCMVmIL,12的構建：用HindⅢ、Xh
4、ol酶切pCDNA/amp/mIL,12/p40，并將其插入HindⅢ、Xhol酶切后的pCA13中，獲得pCA13mIL,12/p40；同法用HindⅢ和EcoRⅤ酶切pCDNA/amp/mIL,12/p35，并將其插入HindⅢ、EcoRⅤ酶切后的pCA13中，獲得pCA13mIL,12/p35；將BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p40并補平粘端所得小片段與EcoR1酶切pdlE1SP1B并補平粘端所得大片段通過T4DNA連接酶連接，得到pdlE1SP1BmIL,12/p40；將BglⅡ酶切pdlE1SP1BmIL,12/p40所
5、得大片段和BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p35所得小片段連接，得到pdlE1SP1BmIL,12。重組的pdlE1SP1BmIL,12/p40/p35分別含有兩個CMV啟動子和兩個SV40終止信號。用pdlE1SP1BmIL,12轉(zhuǎn)染293細胞，包裝并擴增出AdCMVmIL,12。包裝過程：在1ml無血清培養(yǎng)基中加入5μl脂質(zhì)體（LIPOFECTAMINE）、8μgpJM17及4μgpE1SP1BmIL,12，上述混合液室溫放置15min。棄去細胞培養(yǎng)液，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗兩遍，加入上述混合液，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育3~
6、4h，再加入含20%胎牛血清的DMEM，CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。第二天將細胞分至3個培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補充0.5ml含10%胎牛血清的DMEM，注意觀察細胞病變效應（CPE）的出現(xiàn)。包裝好的腺病毒為AdCMVmIL,12。轉(zhuǎn)染前正常293細胞呈梭狀，連接成片。轉(zhuǎn)染后293細胞固縮成團、部分細胞裂解。1.2.2對重組腺病毒鑒定用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Xhol對重組腺病毒DNA進行常規(guī)酶切鑒定。1.2.3重組腺病毒的擴增和滴度測定取經(jīng)酶切鑒定正確的AdCMVmIL,12感染293細胞，大量擴增AdCMVmIL,12。將擴增后的病毒液做
7、倍比稀釋，在96孔板上感染293細胞進行病毒滴定，觀察每孔中的細胞病變效應（CPE）。以出現(xiàn)CPE的最高稀釋度為病毒滴度。1.2.5AdCMVmIL,12抑瘤性實驗注射1×106個H22細胞于昆明種小鼠皮下，并在長成的瘤體內(nèi)分別注射AdCMVLuc和AdCMVmIL,12（含1×109pfu）稀釋液。注射當天為0天，每隔1天觀察1次腫瘤生長情況，并用卡尺測量腫瘤最小直徑（a）和最大直徑（b），按照公式（V=a2·b/2）計算腫瘤體積。觀察AdCMVmIL,12對H22的抑制作用。2結(jié)果2.1AdCMVmIL,12用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和
8、Xhol作酶切鑒定在1644bp處出現(xiàn)目的基因電泳條帶，經(jīng)過比對與預想的基因片段完全相同，證明包裝的腺病毒是完全正確的，酶切結(jié)果見圖1。2.2AdCMVmIL,12的生物學活性測定結(jié)果顯示Ad
