苯丁酸鈉體外對人肝癌細(xì)胞hepg2增殖和凋亡的影響論文

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1、苯丁酸鈉體外對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響論文孟玫，王春亭，蔣進(jìn)皎，張繼承，姜軍梅【摘要】［目的］探討組蛋白去乙?；敢种苿┍蕉∷徕c（PB）體外對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響。［方法］不同濃度苯丁酸鈉處理HepG2，應(yīng)用MTT比色法觀察苯丁酸鈉對HepG2的生長抑制作用，落射熒光顯微鏡、DNA電泳和流式細(xì)胞儀觀察HepG2的凋亡，I1640（Gibco公司產(chǎn)品），置于37°C5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。48h傳代，0.25%的胰酶、0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）消化。取對數(shù)生

2、長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。1．2藥物苯丁酸鈉購自ALEXIS，用RPMI1640培養(yǎng)基溶解為20mmol/L濃度備用。1．3四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色實驗將HepG2細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×104/ml，每孔200μl接種于96孔板，實驗組分別加入不同濃度的苯丁酸鈉，對照組不加藥，另設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組設(shè)三個平行重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48h、72h各取三孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200μl，過夜。震蕩15min

3、，用全自動酶標(biāo)儀（DenleyDrangonK2）檢測570nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對照-A實驗）/（A對照-A空白）×100%。1．4熒光染色觀察細(xì)胞凋亡常規(guī)收集對照組、苯丁酸鈉處理組細(xì)胞，4℃PBS洗滌2次。加入熒光染料Hoechst33342（Anaspec產(chǎn)品）至終濃度為2.5μg/ml，37℃避光孵育染色30min，取細(xì)胞懸液滴于清潔的載玻片，蓋上蓋玻片，落射熒光顯微鏡（JEOL-1200EX型）下觀察細(xì)胞。1．5流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡對數(shù)生長期的細(xì)胞用無

4、血清的RPMI1640培養(yǎng)24h同步化后，分組干預(yù)48h。收集不同處理組細(xì)胞，4℃PBS洗滌2次，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，取100μl細(xì)胞懸液與含1%RNA酶的Tis-HCl緩沖液混勻共同孵育10min，加入碘化丙啶（PI）和異硫氰酸熒光素（flucresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的磷脂酰結(jié)合蛋白（AnnexinV）各5μl混勻，避光37℃孵育30min，F(xiàn)CM（FACScan美國BD公司產(chǎn)品）檢測，凋亡細(xì)胞AnnexinV-FITC（+）PI（-），正

5、常活細(xì)胞AnnexinV-FITC（-）PI（-），壞死細(xì)胞AnnexinV-FITC（+）PI（+），利用CellQuest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。1．6DNA電泳收集對照組，苯丁酸鈉處理組細(xì)胞各5×107，4℃PBS洗滌2次，采用常規(guī)的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法。提取出的DNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色AlphalmagerTM2200數(shù)字電泳凝膠成像系統(tǒng)成像分析。1．7Tris-HClpH7.5，150mMNaCl，1g/LSDS，1mMDTT，10ml/LN

6、p-40，10g/L脫氧膽酸鈉，25mg/L亮抑素，25mg/L胰蛋白酶抑制劑，1mMPMSF）提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量采用BCA法。調(diào)節(jié)每份樣品濃度，加入等體積2×SDS加樣緩沖液，煮沸5min。每孔加樣20μg蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，與鼠抗人Bcl-2（C-2）、鼠抗人Bax(N-20)單克隆抗體37℃溫育2h，4℃過夜。與堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG37℃溫育1h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室顯色1min，X線片曝光，利用AlphalmagerTM2200圖像處理軟件對結(jié)果進(jìn)

7、行輝度掃描，計算電泳條帶的積分吸光值。以上抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，顯色劑由武漢博士德公司提供。1．8統(tǒng)計學(xué)處理每次實驗至少重復(fù)3次，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS軟件進(jìn)行one-mol/L作用48h后HepG2細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核變小，染色質(zhì)聚集呈不均勻塊狀并發(fā)出粉紅色熒光，部分碎裂成凋亡小體。苯丁酸鈉可誘導(dǎo)HepG2凋亡，見圖1。2．3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡對照組和處理組相比較，對照組早期凋亡的細(xì)胞24h、48h、72h分別為9.6%±1.5%、18.4%±2.3%、2

8、1.2%±2.6%，苯丁酸鈉4mmol/L處理24h、48h、72h早期凋亡細(xì)胞分為37.2%±1.6%、48.3%±3.7%、56.8%±3.5%，各時間凋亡細(xì)胞比較差異均有顯著性（P0.05），提示苯丁酸鈉可誘導(dǎo)HepG2凋亡（見圖2）。分別提取苯丁酸鈉4mmol/L處理48h、72h和對照組的細(xì)胞DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，苯丁酸鈉處理組的細(xì)胞可見典型的DNA梯型條帶，提示有細(xì)胞凋亡發(fā)生（見圖3）。2.4TT結(jié)果顯示苯丁酸鈉的作用有時間和劑量效應(yīng)關(guān)系（P0.05）。經(jīng)苯丁酸鈉處理的細(xì)胞DNA凝