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《人熱休克蛋白72基因的克隆、原核表達(dá)與純化論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人熱休克蛋白72基因的克隆、原核表達(dá)與純化論文.freels;cellline;heatshockprotein72;cloning;geneexpressionAbstract:AIMToclonehumanheatshockprotein72（HSP72）gene，doprokaryoticexpressionandpurifyHSP72proteinforfurtherstudy.METHODSHumanHSP72geneheatshockedhumanhepato-carcinomacelllineSMMC-7721.Itsprod
2、uctedtoE.colistrainJM109.Theproteins，expressedinE.colistrainidunderIPTGinduction，atographyandcharacterizedbySDS-PAGEandMC-7721經(jīng)42℃熱休克2h，于休克后16h［2］根據(jù)試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以其為模板PCR擴(kuò)增HSP72目的片段.反應(yīng)條件:去離子水37μL，cDNA1μL，引物各1μL，10×buffer5μL，25mmolL-1dNTP1μL，10mmolL-1MgCl23μL，混
3、勻，94℃變性5min，冰浴1min后，加入TaqDNA聚合酶1μL.PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù):先95℃預(yù)變性5min，然后按94℃1min，55℃1min，72℃2min的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min.1.2.3HSP72基因的克隆與測(cè)序經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在10gL-1瓊脂糖凝膠上電泳鑒定.將質(zhì)粒pUC19和目的片段經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切，回收載體和目的片段，在T4DNA連接酶作用下12℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定后行全基因的全自動(dòng)序列分析.1.2.4
4、HSP72基因的原核表達(dá)從經(jīng)測(cè)序鑒定后的pUC19-HSP72中EcoRI和PstI雙酶切回收HSP72目的基因片段，并與經(jīng)同樣限制酶雙酶切的原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-30相連接，建立原核表達(dá)載體pQE-30HSP72，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定后將含有表達(dá)載體的單一菌落在LB培養(yǎng)基（含100mgL-1氨芐青霉素）中過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接至新的10gL-1LB肉湯管（含2gL-1葡萄糖、100mgL-1氨芐青霉素）中，繼續(xù)培養(yǎng)至A值約為0.4～0.6，37℃加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmolL-1，取誘導(dǎo)0，0.5，
5、1，2，3和4h各組樣品，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，并用anti-HSP72單抗作109菌經(jīng)培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，12000g離心5min收集沉淀、經(jīng)30mmolL-1NaHCO3（pH7.4）溶液4℃低滲30min，12000g離心15min取上清，PEG20000濃縮后過FPLC離子交換柱［4］，梯度洗脫，收集峰值蛋白液;濃縮后分別過SephacrylS200凝膠柱，收集峰值蛋白液;純化蛋白液分別用SDS-PAGE檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量，并用anti-HSP72單抗作探針，進(jìn)行MC-7721擴(kuò)增得到了長度約1.9kb的DNA片段（Fi
6、g1）.克隆基因的全自動(dòng)序列分析結(jié)果與GeneBank所報(bào)道的人HSP72基因序列相一致.圖1重組pQE-30HSP72載體DNA酶切后電泳圖略2.2重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定重組原核表達(dá)載體pQE-30HSP72轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，經(jīng)質(zhì)粒提取和10gL-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，用EcoRI酶切的A組，在5400bp處有一條帶，經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切的B組，在1900bp處和3500bp處各有一條帶（Fig1）.2.3pQE┐30HSP72表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)重組pQE-30HSP72轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，用IPTG誘導(dǎo)表
7、達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組0h均無明顯表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組0.5，1，2，3和4h各組可見在Mr72000處有一蛋白帶，隨時(shí)間延長表達(dá)產(chǎn)物增多，2h時(shí)最多（Fig2）.用r72000處有一與anti-HSP72單抗結(jié)合帶，隨時(shí)間延長而加深.2.4純化蛋白的鑒定經(jīng)FPLC梯度洗脫和SephacrylS200凝膠過濾純化的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)在Mr72000處有一條帶，用anti-HSP72單抗行r72000處有一抗體結(jié)合帶（Fig3）.圖2－圖3略3討論HSP72是HSP70家族的主要成員，是熱休克蛋白73（HSP73）的類似蛋
8、白，HSP73主要呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)于幾乎所有細(xì)胞，而在哺乳動(dòng)物中正常情況下很難測(cè)出HSP72，但在應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)下HSP72會(huì)大量合成［5］.兩者不僅相對(duì)分子質(zhì)量相似，其結(jié)構(gòu)、功能及生
