大鼠肝細(xì)胞與kupffer細(xì)胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響論文

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1、大鼠肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響論文寇晨光曹成波燕曉雯羅兵周巖冰【摘要】目的觀察大鼠肝實質(zhì)細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞體外共同培養(yǎng)時對兩者生長、形態(tài)及功能的影響。方法采用原位二步Ⅳ型膠原灌注法、Percoll液密度梯度離心法分離I1640完全培養(yǎng)基購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所;Ⅳ型膠原酶、2.5g/L胰酶、錐蟲藍(lán)均購于美國Sigma公司;Percoll液購自于北京華美公司;考馬斯亮藍(lán)G250、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由杭州博日生物技術(shù)有

2、限公司提供;125I腫瘤壞死因子α(TNFα)放射免疫分析試劑盒、125I白細(xì)胞介素1(IL1)放射免疫分析試劑盒、125I白細(xì)胞介素6(IL6)放射免疫分析試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。1.2方法1.2.1肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞的分離本文參照SMEDSROD等5方法加以改良分離收集肝細(xì)胞，利用Percoll液密度梯度離心法收集Kupffer細(xì)胞。1.2.2肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的培養(yǎng)及觀察單獨培養(yǎng)組調(diào)整肝細(xì)胞密度至1.5×108/L并接種到培養(yǎng)皿，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05

3、CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。共同培養(yǎng)組將肝細(xì)胞按1.5×108/L的細(xì)胞密度、Kupffer細(xì)胞按2.5×107/L細(xì)胞密度(6∶1)共同接種于培養(yǎng)皿，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。每培養(yǎng)12h更換培養(yǎng)液并吸取上清液用全自動生化檢測儀檢測清蛋白、ALT、AST、IL1、IL6、TNFα，并觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。1.2.3檢測指標(biāo)采用考馬斯亮藍(lán)G250方法測定清蛋白，采用ELISA法分別檢測

4、上清液中ALT、AST、IL1、IL6及TNFα含量。1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用PPMS1.5軟件6進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗。2結(jié)果2.1形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下，新分離的大鼠肝細(xì)胞晶瑩透亮，呈圓球形，折光性強，有立體感。臺盼藍(lán)染色計數(shù)顯示健康肝細(xì)胞的比例平均為92%。同時，新分離的Kupffer細(xì)胞胞漿透亮，多呈圓球形，少數(shù)呈多形性，散在分布，大小不一致，約6h后，細(xì)胞開始伸展，體積增大，48h后細(xì)胞充分展開，呈典型的星形或多邊形，邊界不清。在單獨培養(yǎng)組，肝細(xì)胞的生長

5、、增殖較共同培養(yǎng)組的細(xì)胞迅速，接種4h后肝細(xì)胞貼壁、伸展，連接成條索狀;24h后絕大多數(shù)肝細(xì)胞貼壁，呈扁平狀，體積明顯增大;48h后肝細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞開始增殖，細(xì)胞間出現(xiàn)島狀連接，部分肝細(xì)胞呈雙核;72h后肝細(xì)胞開始增殖，在原來肝細(xì)胞周圍出現(xiàn)透明且體積較小的上皮樣細(xì)胞，呈多邊形，逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底;10d后培養(yǎng)液的上清中懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞開始大量死亡;至培養(yǎng)15d時細(xì)胞全部死亡。在共同培養(yǎng)組，24h后絕大多數(shù)肝細(xì)胞貼壁，呈扁平狀，體積增大;肝細(xì)胞生長增殖緩慢，于96h即開始出現(xiàn)少量的死亡細(xì)胞漂浮，

6、至培養(yǎng)10d時細(xì)胞基本全部死亡。2.2功能測定共同培養(yǎng)組清蛋白水平在24、36、48、60h低于于單獨培養(yǎng)組(t=2.551～3.139，P0.05);共同培養(yǎng)組ALT、AST水平在24、36、48、60h明顯高于單獨培養(yǎng)組(t=2.446～3.108，P0.05);培養(yǎng)36h后，共同培養(yǎng)組上清液中IL1為(0.17±0.03)μg/L，IL6為(0.03±0.01)μg/L，TNFα為(39.73±5.26)pmol/L，而單獨培養(yǎng)組未檢測到上述細(xì)胞因子。見表1～3。表1各組大鼠肝細(xì)胞上清中清

7、蛋白水平比較(ρ/g·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組60.679±0.0450.556±0.0300.535±0.0440.536±0.044共同培養(yǎng)組60.548±0.059*0.472±0.057*0.468±0.047*0.477±0.033*與單獨培養(yǎng)組比較,*t=2.551～3.139，P0.05。表2各組大鼠肝細(xì)胞上清中ALT水平比較(z/U·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組682.40±4.1882.90±2.6080.90±4.1682.8

8、0±2.92共同培養(yǎng)組689.90±3.69*86.90±2.62*87.20±3.50*89.80±4.65*與單獨培養(yǎng)組比較,*t=2.666～3.108，P0.05。表3各組大鼠肝細(xì)胞上清中AST水平比較(z/U·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組6142.20±5.54140.50±6.44150.60±4.42149.50±3.94共同培養(yǎng)組6151.20±5.57*148.90±5.33*160.80±6.78*155.6