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1、大鼠肝細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響：寇晨光曹成波燕曉雯羅兵周巖冰【摘要】目的觀察大鼠肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞體外共同培養(yǎng)時對兩者生長、形態(tài)及功能的影響。方法采用原位二步Ⅳ型膠原灌注法、Percoll液密度梯度離心法分離ofthecellsunderdifferentcircumstanceseasuredbyradioimmunoassayat36hours.ResultsInsolitary?culturegroup,thehepatocytesgreofnormallivercells,eninsupernateo
2、fco?culturegroup,at24h,36h,48hand60h,etimepointsasabove,aintainedforempiricalstudy. [KEYins;cytokines;rats 肝細胞分離、培養(yǎng)是研究肝臟和肝細胞的良好方法。盡管肝細胞在體內(nèi)擁有相當強的增殖能力，但要肝細胞在體外保持分化狀態(tài)且能繼續(xù)增殖卻非常困難。要明確影響肝細胞生長、分化和死亡的因素等，仍然面臨認識水平和技術(shù)的挑戰(zhàn)。實驗已證實，肝實質(zhì)細胞與非肝實質(zhì)細胞或非肝細胞的共同培養(yǎng)可有效延長肝細胞的生存時間，促進肝細胞增殖;有助于保持細胞間特有的膽管結(jié)
3、構(gòu)，促進形成縫隙連接;可促進肝細胞的合成和分泌功能;有助于肝細胞維持其解毒功能[1?4]。目前進行的共同培養(yǎng)主要有肝細胞?非肝細胞培養(yǎng)或肝實質(zhì)細胞?非實質(zhì)細胞培養(yǎng)，而對肝細胞與Kupffer細胞的共同培養(yǎng)的報道還較少。本實驗在體外將肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)，觀察體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中肝細胞形態(tài)、生長情況、功能的變化以及Kupffer細胞細胞因子分泌情況,旨在為肝細胞在病毒學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)及肝細胞移植等方面的研究提供良好的平臺。 1材料與方法 1.1材料 雄性I?1640完全培養(yǎng)基購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所;Ⅳ型膠原酶、2
4、.5g/L胰酶、錐蟲藍均購于美國Sigma公司;Percoll液購自于北京華美公司;考馬斯亮藍G?250、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由杭州博日生物技術(shù)有限公司提供;125I腫瘤壞死因子?α(TNF?α)放射免疫分析試劑盒、125I白細胞介素1(IL?1)放射免疫分析試劑盒、125I白細胞介素?6(IL?6)放射免疫分析試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。 1.2方法 1.2.1肝細胞及Kupffer細胞的分離本文參照SMEDSROD等[5]方法加以改良分離收集肝細胞，利用Percoll液密度梯度離心法收集Ku
5、pffer細胞?！ ?.2.2肝細胞和Kupffer細胞的培養(yǎng)及觀察單獨培養(yǎng)組調(diào)整肝細胞密度至1.5×108/L并接種到培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)0.05CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。共同培養(yǎng)組將肝細胞按1.5×108/L的細胞密度、Kupffer細胞按2.5×107/L細胞密度(6∶1)共同接種于培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)0.05CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。每培養(yǎng)12h更換培養(yǎng)液并吸取上清液用全自動生化檢測儀檢測清蛋白、ALT、AST、IL?1、IL?6、TNF?α，并觀察
6、細胞形態(tài)及生長情況?！ ?.2.3檢測指標采用考馬斯亮藍G?250方法測定清蛋白，采用ELISA法分別檢測上清液中ALT、AST、IL?1、IL?6及TNF?α含量?！ ?.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用PPMS1.5軟件[6]進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗。 2結(jié)果 2.1形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下，新分離的大鼠肝細胞晶瑩透亮，呈圓球形，折光性強，有立體感。臺盼藍染色計數(shù)顯示健康肝細胞的比例平均為92%。同時，新分離的Kupffer細胞胞漿透亮，多呈圓球形，少數(shù)呈多形性，散在分布，大小不一致，約6h后，細胞開始伸展，體積增大
7、，48h后細胞充分展開，呈典型的星形或多邊形，邊界不清。在單獨培養(yǎng)組，肝細胞的生長、增殖較共同培養(yǎng)組的細胞迅速，接種4h后肝細胞貼壁、伸展，連接成條索狀;24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積明顯增大;48h后肝細胞貼壁牢固，細胞開始增殖，細胞間出現(xiàn)島狀連接，部分肝細胞呈雙核;72h后肝細胞開始增殖，在原來肝細胞周圍出現(xiàn)透明且體積較小的上皮樣細胞，呈多邊形，逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底;10d后培養(yǎng)液的上清中懸浮細胞逐漸增多，細胞開始大量死亡;至培養(yǎng)15d時細胞全部死亡。在共同培養(yǎng)組，24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積增大;肝細胞生長增殖緩慢，于9
8、6h即開始出現(xiàn)少量的死亡細胞漂浮，至培養(yǎng)10d時細胞基本全部死亡?！ ?.2功能測定 共同培養(yǎng)組清蛋白水平在24、36、
