大鼠肝細胞與kupffer細胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響

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1、大鼠肝細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響：寇晨光曹成波燕曉雯羅兵周巖冰【摘要】目的觀察大鼠肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞體外共同培養(yǎng)時對兩者生長、形態(tài)及功能的影響。方法采用原位二步Ⅳ型膠原灌注法、Percoll液密度梯度離心法分離I1640完全培養(yǎng)基購于中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所;Ⅳ型膠原酶、2.5g/L胰酶、錐蟲藍均購于美國Sigma公司;Percoll液購自于北京華美公司;考馬斯亮藍G250、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由杭州博日生物技術有限公司提供;125I腫瘤壞死因子

2、α(TNFα)放射免疫分析試劑盒、125I白細胞介素1(IL1)放射免疫分析試劑盒、125I白細胞介素6(IL6)放射免疫分析試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。　　1.2方法　　1.2.1肝細胞及Kupffer細胞的分離本文參照SMEDSROD等[5]方法加以改良分離收集肝細胞，利用Percoll液密度梯度離心法收集Kupffer細胞。　　1.2.2肝細胞和Kupffer細胞的培養(yǎng)及觀察單獨培養(yǎng)組調(diào)整肝細胞密度至1.5×108/L并接種到培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)0.05CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，

3、12h后更換新鮮培養(yǎng)液。共同培養(yǎng)組將肝細胞按1.5×108/L的細胞密度、Kupffer細胞按2.5×107/L細胞密度(6∶1)共同接種于培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)0.05CO2孵箱，在37℃、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。每培養(yǎng)12h更換培養(yǎng)液并吸取上清液用全自動生化檢測儀檢測清蛋白、ALT、AST、IL1、IL6、TNFα，并觀察細胞形態(tài)及生長情況?！　?.2.3檢測指標采用考馬斯亮藍G250方法測定清蛋白，采用ELISA法分別檢測上清液中ALT、AST、IL1、IL6及TNFα含量?！　?.3統(tǒng)

4、計學處理　　采用PPMS1.5軟件[6]進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗。　　2結果　　2.1形態(tài)學觀察　　倒置顯微鏡下，新分離的大鼠肝細胞晶瑩透亮，呈圓球形，折光性強，有立體感。臺盼藍染色計數(shù)顯示健康肝細胞的比例平均為92%。同時，新分離的Kupffer細胞胞漿透亮，多呈圓球形，少數(shù)呈多形性，散在分布，大小不一致，約6h后，細胞開始伸展，體積增大，48h后細胞充分展開，呈典型的星形或多邊形，邊界不清。在單獨培養(yǎng)組，肝細胞的生長、增殖較共同培養(yǎng)組的細胞迅速，接種4h后肝細胞貼壁、伸展，連接成條索狀;24h

5、后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積明顯增大;48h后肝細胞貼壁牢固，細胞開始增殖，細胞間出現(xiàn)島狀連接，部分肝細胞呈雙核;72h后肝細胞開始增殖，在原來肝細胞周圍出現(xiàn)透明且體積較小的上皮樣細胞，呈多邊形，逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底;10d后培養(yǎng)液的上清中懸浮細胞逐漸增多，細胞開始大量死亡;至培養(yǎng)15d時細胞全部死亡。在共同培養(yǎng)組，24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積增大;肝細胞生長增殖緩慢，于96h即開始出現(xiàn)少量的死亡細胞漂浮，至培養(yǎng)10d時細胞基本全部死亡?！　?.2功能測定　　共同培養(yǎng)組清蛋白水平在24、36、48、60h低于于單

6、獨培養(yǎng)組(t=2.551～3.139，P<0.05);共同培養(yǎng)組ALT、AST水平在24、36、48、60h明顯高于單獨培養(yǎng)組(t=2.446～3.108，P<0.05);培養(yǎng)36h后，共同培養(yǎng)組上清液中IL1為(0.17±0.03)μg/L，IL6為(0.03±0.01)μg/L，TNFα為(39.73±5.26)pmol/L，而單獨培養(yǎng)組未檢測到上述細胞因子。見表1～3?！　”?各組大鼠肝細胞上清中清蛋白水平比較(ρ/g·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組60.679±0.0450.556

7、±0.0300.535±0.0440.536±0.044共同培養(yǎng)組60.548±0.059*0.472±0.057*0.468±0.047*0.477±0.033*與單獨培養(yǎng)組比較,*t=2.551～3.139，P<0.05。　　表2各組大鼠肝細胞上清中ALT水平比較(z/U·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組682.40±4.1882.90±2.6080.90±4.1682.80±2.92共同培養(yǎng)組689.90±3.69*86.90±2.62*87.20±3.50*89.80±4.65*與單獨培養(yǎng)組比較

8、,*t=2.666～3.108，P<0.05?！　”?各組大鼠肝細胞上清中AST水平比較(z/U·L-1，±s)組別n24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組6142.20±5.54140.50±6.44150.60±4.42149.50±3.94