靶向大鼠ctgf的shrna表達(dá)載體的構(gòu)建和作用分析

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1、靶向大鼠CTGF的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和作用分析作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，楊漢東，閔新文【摘要】　　目的:構(gòu)建并篩選靶向大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的shRNA表達(dá)載體.方法:根據(jù)大鼠CTGFmRNA序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個(gè)靶向大鼠CTGF基因的shRNA干擾質(zhì)粒；然后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心肌成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)分選出成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞.通過RTPCR和:ToconstructandscreenoutthepotentshorthairpinRNA(shRNA)expressingplasmidsidstargetingtoratCT

2、GFmRNA(AccessionNo:NM_022266)RNA.Therebinantplasmidseassayandnucleotidesequenceanalysis.Thentheplasmidsine2000reagent,andthepositivecellsRNAandprotEinexpressionsofCTGFid.RESULTS:The4rebinantplasmidvectorsexpressingCTGFtargetingshRNAeassayandsequenceanalysis.FortyEIghthoursposttrans

3、fection,themRNAandproteinexpressionsofCTGFdecreasedin3experimentalgroupsparedidandlipofectamine2000group.CONCLUSION:FourrebinantplasmidstargetingtoratCTGFaresuccessfullyconstructed,and3potentrebinantplasmidsarescreenedout.ThislaysafoundationforfurtherresearchesofRNAinterferenceoncard

4、iacfibrosisinvivoandinvitro.【Keyid;transfect;cardiacfibrosis　　0引言結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissuegroRNA水平的干擾技術(shù)，具有相對(duì)簡(jiǎn)單、抑制作用更為完全、特異性高等特點(diǎn)，在高通量研究基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及進(jìn)行靶向基因靜默治療等方面廣泛應(yīng)用.本研究通過構(gòu)建并篩選CTGF靶向特異性的shRNA（shorthairpinRNA）真核表達(dá)載體，為今后通過RNAi技術(shù)抑制CTGF表達(dá)、從基因與蛋白質(zhì)水平探索CTGF在促心肌纖維化的作用打下基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料真核表達(dá)載體pGen

5、esil1質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶BamHI,HindⅢ,SalI,PstI和T4多聚核苷酸激酶及其緩沖液均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司;T4DNA連接酶及緩沖液購(gòu)自Neine2000購(gòu)于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz;HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗及ECL試劑盒購(gòu)于Pierce公司.1.2方法1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成CTGF靶向性shRNA干擾序列的設(shè)計(jì)合成參見2結(jié)果2.1選定的靶序列及針對(duì)每條靶序列設(shè)計(jì)的雙鏈shRNA靶序列結(jié)構(gòu)模式：BamHI

6、+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+SalI+HindIIICTGF1:AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC;CTGF1A:5′GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3′;CTGF1B:3′GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5′;CTGF2:AAAGATGGTGCACCCTGTGTC;CTGF2A:5′GATCCAGATGGTGCACCC

7、TGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3′;CTGF2B:3′GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5′;CTGF3:GAGTCCTTCCAAAGCAGTT;CTGF3A:5′GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3′;CTGF3B:3′GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATACCTGTTTGACGAA

8、ACCTT