人smad3的shrna表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定論文

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1、人Smad3的shRNA表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定論文謝橋生雷小英王立鋒孟艷玲王芳薛茜溫偉紅楊安鋼【摘要】目的：構(gòu)建人Smad3的shRNA表達(dá)載體，運(yùn)用RNAi下調(diào)Smad3基因在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，觀察對腫瘤細(xì)胞生長的影響.方法：化學(xué)合成針對人Smad3基因的dsRNA，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，檢測RNA干擾效果，篩選有效干擾靶位點(diǎn)；設(shè)計(jì)并合成針對人Smad3基因的siRNA寡核苷酸鏈，經(jīng)退火形成雙鏈后克隆入質(zhì)粒載體pSilencerTM3.1H1hygro，轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞.freelycinB篩選穩(wěn)定單克

2、隆細(xì)胞株，對細(xì)胞株行RTPCR和3.1H1hygro由西京醫(yī)院劉家云博士惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、宮頸癌細(xì)胞系Hela由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)試劑、TRIZOLReagentRTPCR試劑盒、hygromycinB，LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（BSA）、兔抗人antiSmad3多克隆抗體（sc8332，SantaCruz公司）；兔抗人antiActin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；NC膜（Millipore公司）；BCA

3、法蛋白定量試劑盒、JResearch公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Model500，BIORAD公司）.1.2方法1.2.1siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)RNA干擾靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)原則，從Smad3mRNA（NM_005902）的編碼序列中尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶位點(diǎn)，經(jīng)BLAST軟件進(jìn)行同源分析證實(shí)為Smad3特異性序列后，選擇其編碼區(qū)第941～959位核苷酸為干擾靶位點(diǎn)，由上海吉瑪公司合成其dsRNA序列，Smad3正義鏈：5′GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT3′，反義鏈：5′CGUGUAUUAUUGAAC

4、CUGGdTdT3′.由公司提供的陰性對照dsRNA與人類基因無同源性，正義鏈：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3′，反義鏈：5′AAGAGGCUUGCACAGUGCAdTdT3′.1.2.2shRNA表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建按上述靶位點(diǎn)構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，根據(jù)pSilencerTM3.1H1hygro質(zhì)粒載體的要求設(shè)計(jì)1對能編碼shRNA的寡核苷酸鏈，正義鏈：5′GATCCGCACATAATAACTTGGACCTTCAAGAGAGGTCCAAGTTATTATGTGCTTTTT

5、TGGAAA3′，反義鏈：5′AGCTTTTCCAAAAAAGCACATAATAACTTGGACCTCTCTTGAAGGTCCAAGTTATTATGTGCG3′；序列兩端包含BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，交由上海生工合成.陰性對照質(zhì)粒為公司提供的針對綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP)的干擾載體，正義鏈：5′GATCCGGTTATGTACAGGAACGCATTCAAGAGATGCGTTCCTGTACATAACCTTTTTTGGAAA3′，反義鏈：5′AG

6、CTTTTTCCAAAAAGGTTATGTACAGGAACGCATCTCTTGAATGCGTTCCTGTACATAACCG3′.取寡核苷酸鏈制備退火雙鏈DNA，連接入經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pSilencerTM3.1H1hygro載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素陽性瓊脂板上長出菌落，挑取單個(gè)菌落送交北京奧科生物公司測序.1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及單克隆細(xì)胞株的篩選常規(guī)培養(yǎng)Hela細(xì)胞于含100mL/L胎牛血清的RMPI1640，50mL/LCO2中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前24h，接種細(xì)胞

7、于6孔板中（2×105/孔），按LipofectamineTM2000操作說明轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆細(xì)胞株時(shí)，于轉(zhuǎn)染前24h接種細(xì)胞于6孔板中（5×105/孔），轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的RMPI1640，50mL/LCO2，150mg/LhygromycinB中，2ycinB篩選壓力下，經(jīng)歷3ad3的單克隆細(xì)胞株.1.2.4RTPCR檢測基因mRNA表達(dá)水平在6孔板中，每孔加入TRIZOLReagent1mL提取細(xì)胞總RNA，操作按試劑說明書進(jìn)行，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA.用專

8、業(yè)軟件設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參照βactin上游引物：5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′；下游引物：5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′.Smad2上游引物：5′TTCCGCCTCTGGATGACTA3′；下游引物：5′TTTCTACCGTGGCATTTCG3′.Smad3上游引物：5′CACGCAGAACGTCAACAC3′；下游引物：5′GTGA