doc2抑制對宮頸癌siha細(xì)胞系的生長論文

《doc2抑制對宮頸癌siha細(xì)胞系的生長論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、DOC2抑制對宮頸癌SiHa細(xì)胞系的生長論文李萍，辛?xí)匝啵瑒⑹缇?，宋慶賀，毛敬【關(guān)鍵詞】宮頸癌InhibitoryeffectofDOC2geneongroancervicalcancerSiHacells【Abstract】AIM:ToexploretheinhibitoryeffectofDOC2geneonthegroancervicalcancercelllineSiHa.METHODS:RebinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1p93(containingexogenoushuman

2、DOC2cDNA)andvectorpcDNA3.1(ycinresistancegeneonly)ancervicalcancerSiHacells(noDOC2geneexpression)inerespectively.Thegroationrateoftransfectedcellsarkedlysuppressed（P0.05）.Colonyformationrateinsoftagarancervicalcancer.【Keys;DOC2;genetherapy【摘要】目的：探討卵巢癌缺失2(DOC2)基因?qū)m頸癌SiHa

3、細(xì)胞系生長的抑制作用.方法：采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將含有全長DOC2cDNA的真核重組表達(dá)質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒(pcDNA3.1)轉(zhuǎn)染到人宮頸癌SiHa細(xì)胞系（無DOC2基因的表達(dá)）中，了解其對細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響.結(jié)果：轉(zhuǎn)染DOC2基因的宮頸癌細(xì)胞生長受到抑制（P0.05），其在軟瓊脂克隆形成能力明顯降低（P0.05）.DOC2有使G1期細(xì)胞比例增高、S期細(xì)胞比例下降的趨勢,但SiHa細(xì)胞和SiHapcDNA3.1細(xì)胞之間無顯著差異.結(jié)論：DOC2基因能抑制宮頸癌細(xì)胞系的增殖.【關(guān)鍵詞】宮頸腫瘤；DOC2；基因療法0引言卵巢癌缺失2

4、（differentiallyexpressedinovariancancer2,DOC2）基因能抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長.freelL/LCO2標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng).真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCDNA3.1p93(含有人DOC2cDNA)、空載體質(zhì)粒pCDNA3.1和免疫組化試劑DOC2抗體均由劉淑娟博士惠贈［1-2］.DMEM，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Lipofectamine2000）及胰蛋白酶購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青;MTT購自華美生物工程公司；SABC試劑盒與DAB顯色劑均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司,G418購自Sigma公

5、司.1.2方法取pCDNA3.1p932.5μL（2.0μg）與無血清DMEM250μL混勻得A液，另取Lipofectamin20005μL和無血清DMEM250μL混勻得B液.A與B兩液混勻，室溫放置20min形成脂質(zhì)體pCDNA3.1p93復(fù)合物(C1液)；同法制備脂質(zhì)pCDNA3.1復(fù)合物(C2液).用C1液和C2液分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的SiHa作對照.轉(zhuǎn)染48h后，向培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行篩選，瓶中G418終濃度由100mg/L逐漸升至400mg/L，每3d提高1次濃度，篩選抗G418克隆，挑選陽性克隆并擴(kuò)大

6、培養(yǎng).轉(zhuǎn)染克隆采用ABC免疫酶染色法檢測DOC2蛋白的表達(dá).取處于對數(shù)生長期的SiHap93細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化并制備SiHap93單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔加1mL培養(yǎng)基，于接種后24h開始加入MTT,每次6個復(fù)孔,每孔加入75μLMTT（20g/L）,37℃,50mL/LCO2孵箱孵育4h后棄去上清，每孔加入0.5mLDMSO，振蕩15min，再孵育1h，使結(jié)合的MTT充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔A值，每日測量1次，連續(xù)7d,并繪制A值時(shí)間曲線.測量期間每2~3d換液1次.

7、同法繪制SiHa和SiHapcDNA3.1細(xì)胞的A值時(shí)間曲線,作為對照.用去離子水配制7g/L和12g/L瓊脂溶液，高溫高壓滅菌后，于45℃水浴保溫備用.配制2×DMEM培養(yǎng)液，高溫高壓滅菌后45℃水浴保溫.將2×DMEM與12g/L瓊脂溶液等體積混勻后，按1mL/孔加入24孔培養(yǎng)板，4℃放置30min使之凝固.再將2×DMEM與7g/L瓊脂溶液等體積混勻，之后加入SiHap93單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106/L，此混懸液按每孔0.5mL加入上述24孔板，鋪平后室溫放置使瓊脂凝固，之后置于37℃,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)2

8、L/L乙醇固定過夜.次日再次以PBS洗滌，并調(diào)整細(xì)胞濃度1×108~1×109/L，碘化丙錠染色30min后，應(yīng)用FCM檢測，計(jì)算出各期細(xì)胞百分比,.freelin介導(dǎo)下,轉(zhuǎn)入人宮頸癌SiHa細(xì)胞系中，經(jīng)G418篩選14