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1、紫杉醇對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用論文郭春龍黃艷麗朱曉敏張春陽(yáng)馮祿王贊滔姜華茂【關(guān)鍵詞】紫杉摘要：目的：探討紫杉醇體外抑制膀胱癌EJ細(xì)胞株及誘導(dǎo)凋亡的作用。方法：體外培養(yǎng)膀胱癌EJ細(xì)胞株，以不同濃度紫杉醇處理12～72h后，通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，采用電鏡觀察和DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：紫杉醇能抑制EJ細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在一定劑量和時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間、濃度依賴關(guān)系。電鏡下凋亡細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，并沿核膜分布形成花瓣形。電泳見(jiàn)出現(xiàn)典型的凋亡DNA梯形帶。結(jié)論：紫杉醇能抑制膀胱癌EJ細(xì)胞株的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡可能為其抗
2、腫瘤作用機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：紫杉醇；膀胱癌；細(xì)胞凋亡膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤.freell)；L谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸鈉1mmol/L購(gòu)自華美公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司。12細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌EJ細(xì)胞株購(gòu)自上海午立生物有限公司，培養(yǎng)于含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。13實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組：不加藥，每天更換1640全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組：紫杉醇濃度分別為10、50、100、500nmol/L，接種細(xì)胞24h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開(kāi)始加藥，每天換液以維持藥
3、物濃度恒定。14細(xì)胞毒性分析應(yīng)用MTT比色法測(cè)定不同濃度紫杉醇對(duì)EJ細(xì)胞增殖的影響，并繪制劑量效應(yīng)曲線。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EJ細(xì)胞以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板。接種細(xì)胞24h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開(kāi)始加入不同終濃度的紫杉醇，每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照孔。置于37℃含5％CO2孵箱中分別培養(yǎng)12、24、48、72h后每孔加MTT（5mg/ml）20μl。作用4h后棄上清，各孔加入100μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取吸光度A值。細(xì)胞生
4、長(zhǎng)的抑制率（％）＝（對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100％［2］。15透射電子顯微鏡觀察取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量為106～107）倒出瓶中培養(yǎng)液，用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）洗3min×3次，后加入2.5％戊二醛4℃放置10min。用接種環(huán)刮下細(xì)胞移入離心管中，2000r/min離心15min。用接種環(huán)刮起細(xì)胞塊，將細(xì)胞塊與戊二醛一起轉(zhuǎn)移到青霉素小瓶中，4℃放置2h。用PBS洗3min×3次（注意加液時(shí)一定不要沖散細(xì)胞團(tuán)塊），1％鋨酸在4℃固定1h。PBS洗3min×3次，脫水（50％、70％、80％、90％、100％乙醇各1次15
5、min/次；100％丙酮2次，10min/次）。吸棄瓶中的脫水劑，加3ml純丙酮EPON812包埋劑（1：1體積比），室溫下放置30min后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1ml室溫放置2h或過(guò)夜。吸混合包埋劑2滴于2號(hào)膠囊模塊孔的底部，把細(xì)胞團(tuán)塊移入膠囊底部中心，注意混合包埋劑，置37℃、45℃分別12h，置60℃24h，修塊，制備半薄切片，定位后制備超薄切片，醋酸鉛鈾染色，透射電鏡觀察。16DNA提取及電泳分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EJ單細(xì)胞懸液2×106個(gè)接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，24h后待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始加入不同濃度的紫杉醇，培養(yǎng)48h收集貼壁及懸浮細(xì)胞，1000r/
6、min，離心5min，棄培養(yǎng)液，再加入1mlPBS重懸細(xì)胞移入1ml微量離心管中，1000r/min，離心5min棄上清。加入50μl細(xì)胞裂解液，混勻，于37℃水浴至混合物變得清亮。在高速冷凍離心機(jī)中－4℃12000/min，10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中。以等體積的苯酚/氯仿（1：1），苯酚/氯仿/異丙醇（25：24：1）和氯仿各抽提一次。在上清中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水冷乙醇，于－20℃沉淀過(guò)夜。在－4℃12000r/min離心10min。收集將沉淀溶入20μlTBE緩沖液，加入1μlRNA酶，37℃保溫1h。加入4μl樣
7、品緩沖液，混勻，立即加到含有0.4μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠的樣品中，室溫，于1×TBE緩沖液中5V/cm電壓下電泳1h。以標(biāo)準(zhǔn)品100bpDNAlader為對(duì)照。紫外分析儀觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照［3］。2結(jié)果21MTT結(jié)果隨培養(yǎng)基中紫杉醇濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，EJ細(xì)胞增殖明顯受抑制。50～500nmol/L組作用一定時(shí)間后均可產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制效應(yīng)。其中100nmol/L和500nmol/L組分別于72h、48h達(dá)到IC50，提示紫杉醇對(duì)EJ細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)圖1。22電鏡結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞增殖活躍，內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞核，染色質(zhì)
8、分布均勻。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積
