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《紫杉醇對膀胱癌ej細胞株增殖抑制及誘導凋亡的作用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、紫杉醇對膀胱癌EJ細胞株增殖抑制及誘導凋亡的作用作者：郭春龍黃艷麗朱曉敏張春陽馮祿王贊滔姜華茂【關鍵詞】紫杉 摘要：目的：探討紫杉醇體外抑制膀胱癌EJ細胞株及誘導凋亡的作用。方法：體外培養(yǎng)膀胱癌EJ細胞株，以不同濃度紫杉醇處理12～72h后，通過MTT法測定細胞生長抑制作用，采用電鏡觀察和DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡。結果：紫杉醇能抑制EJ細胞的生長，并在一定劑量和時間范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的時間、濃度依賴關系。電鏡下凋亡細胞體積縮小，染色質濃縮致密，并沿核膜分布形成花瓣形。電泳見出現(xiàn)典型的凋亡DNA梯形帶。結論：紫杉醇能抑制膀胱癌EJ細胞株的生長，誘導凋亡可能為其抗腫瘤作用機制之
2、一?！ ￡P鍵詞：紫杉醇；膀胱癌；細胞凋亡 膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，手術切除是膀胱癌治療的首選方法。但是膀胱癌的易復發(fā)性常使單純采用手術療法難以獲得滿意療效，應用化療作為輔助治療手段可望減少腫瘤患者的復發(fā)率，提高其生存率。紫杉醇（Paclitaxel，商品名：Taxol）是從紫杉樹皮中提取的一種新型抗微管廣譜抗癌藥，具有特異性地穩(wěn)定細胞微管的作用［1］。本研究旨在體外觀察紫杉醇對膀胱癌EJ細胞株的抑制和誘導凋亡作用，以探討紫杉醇對膀胱癌的臨床應用價值。 1材料與方法 11試劑 紫杉醇由上海華聯(lián)制藥有限公司提供，臨用前稀釋至所需濃度；RPMI1640培養(yǎng)基(含10％胎牛
3、血清，青霉素及鏈霉素各100U/ml)；L谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸鈉1mmol/L購自華美公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Sigma公司?！ ?2細胞培養(yǎng) 人膀胱癌EJ細胞株購自上海午立生物有限公司，培養(yǎng)于含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。 13實驗分組 對照組：不加藥，每天更換1640全培養(yǎng)液。實驗組：紫杉醇濃度分別為10、50、100、500nmol/L，接種細胞24h進入對數(shù)生長期后開始加藥，每天換液以維持藥物濃度恒定?！ ?4細胞毒性分析 應用MTT比色法測定不同濃
4、度紫杉醇對EJ細胞增殖的影響，并繪制劑量效應曲線。將對數(shù)生長期的EJ細胞以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細胞懸液，細胞數(shù)為2×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板。接種細胞24h進入對數(shù)生長期后開始加入不同終濃度的紫杉醇，每濃度設4個復孔，并設對照孔。置于37℃含5％CO2孵箱中分別培養(yǎng)12、24、48、72h后每孔加MTT（5mg/ml）20μl。作用4h后棄上清，各孔加入100μlDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀570nm波長處讀取吸光度A值。細胞生長的抑制率（％）＝（對照組A值－實驗組A值）/對照組A值×100％［2］。
5、 15透射電子顯微鏡觀察 取對照組及實驗組細胞（細胞數(shù)量為106～107）倒出瓶中培養(yǎng)液，用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）洗3min×3次，后加入2.5％戊二醛4℃放置10min。用接種環(huán)刮下細胞移入離心管中，2000r/min離心15min。用接種環(huán)刮起細胞塊，將細胞塊與戊二醛一起轉移到青霉素小瓶中，4℃放置2h。用PBS洗3min×3次（注意加液時一定不要沖散細胞團塊），1％鋨酸在4℃固定1h。PBS洗3min×3次，脫水（50％、70％、80％、90％、100％乙醇各1次15min/次；100％丙酮2次，10min/次）。吸棄瓶中的脫水劑，加3ml純丙酮EPO
6、N812包埋劑（1：1體積比），室溫下放置30min后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1ml室溫放置2h或過夜。吸混合包埋劑2滴于2號膠囊模塊孔的底部，把細胞團塊移入膠囊底部中心，注意混合包埋劑，置37℃、45℃分別12h，置60℃24h，修塊，制備半薄切片，定位后制備超薄切片，醋酸鉛鈾染色，透射電鏡觀察?！ ?6DNA提取及電泳分析 取對數(shù)生長期的EJ單細胞懸液2×106個接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，24h后待細胞進入對數(shù)生長期開始加入不同濃度的紫杉醇，培養(yǎng)48h收集貼壁及懸浮細胞，1000r/min，離心5min，棄培養(yǎng)液，再加入1mlPBS重懸細胞移入1ml微量離心管中，1000r/mi
7、n，離心5min棄上清。加入50μl細胞裂解液，混勻，于37℃水浴至混合物變得清亮。在高速冷凍離心機中－4℃12000/min，10min，將上清轉移至另一微量離心管中。以等體積的苯酚/氯仿（1：1），苯酚/氯仿/異丙醇（25：24：1）和氯仿各抽提一次。在上清中加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積的無水冷乙醇，于－20℃沉淀過夜。在－4℃12000r/min離心10min。收集將沉淀溶入20μlTBE緩沖液，加入1μlRNA酶，37℃保溫1h。加入4μl樣品
