蚯蚓纖溶酶抑制胃癌細(xì)胞株mgc803 增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用

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1、蚯蚓纖溶酶抑制胃癌細(xì)胞株MGC803增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用【摘要】目的：研究蚯蚓纖溶酶對人胃癌細(xì)胞株MGC803抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，并初步探討蚯蚓纖溶酶誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。方法：采用MTT法觀察蚯蚓纖溶酶對MGC803細(xì)胞增殖的影響，DNA凝膠電泳技術(shù)觀察凋亡細(xì)胞變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡率的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測蚯蚓纖溶酶對MGC803細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：蚯蚓纖溶酶對胃癌細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈劑量依賴性。蚯蚓纖溶酶4uku·ml-1作用于胃癌細(xì)胞48h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察到典型梯狀條帶。蚯蚓纖溶酶濃度分別為2

2、、4、8uku·ml-1作用于胃癌細(xì)胞48h后均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，各組細(xì)胞凋亡率分別為（29.51±5.54）％、（61.63±7.12）％、（80.82±5.40）％，與對照組相比，凋亡率升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。蚯蚓纖溶酶2、3uku·ml-1組作用于細(xì)胞48h后，p53蛋白表達(dá)減少，平均光強(qiáng)度分別為1.299±0.07、1.203±0.06，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。結(jié)論：蚯蚓纖溶酶在體外可以抑制MGC803細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與蚯蚓纖溶酶抑制p53蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。【關(guān)鍵詞】蚯蚓纖溶酶人胃癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡p

3、53蛋白蚯蚓纖溶酶是從鮮蚯蚓中提取的活性成分，在體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，但其作用機(jī)制一直未能得到充分闡明。研究表明，蚯蚓提取物在體外對多種人癌細(xì)胞株有抑制作用[13]，其抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性成分主要是纖溶酶和纖溶酶原激活酶。李洪燕等[4]用人胃癌BGC823和人乳腺癌B37裸鼠移植瘤模型對蚯蚓纖溶酶進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)觀察，顯示纖溶酶對兩種裸鼠移植瘤生長均有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在體外研究蚯蚓纖溶酶對胃癌細(xì)胞的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。1材料和方法1.1材料蚯蚓纖溶酶由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫生化研究所分離提取，胃癌細(xì)胞株MGC803由解放軍第

4、81醫(yī)院全軍腫瘤中心傳代保存。RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT(Amresco公司)，AnnexinVFITC/PI試劑盒(美國BD公司)，鼠抗人p53單克隆抗體、即用型SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀（BIORAD550，美國伯樂公司），F(xiàn)ACSVantageSE型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)MGC803細(xì)胞于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、鏈霉素150μg·ml-1的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2

5、細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.2.2MTT比色分析取對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞，用含10％小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104ml-1，接種于96孔板，每孔200μl。37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)24h后更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。分為實(shí)驗(yàn)組(再分為蚯蚓纖溶酶1、2、3、4、5、6、7、8uku·ml-1組)、空白組(不加細(xì)胞)和對照組(不加藥)，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48h后每孔加入MTT20μl（5mg·ml-1），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μl終止反應(yīng)，用酶

6、聯(lián)檢測儀于570nm波長處測定每孔光密度(OD值)，計算細(xì)胞生長抑制率，抑制率=[(對照組OD值-空白組OD值)-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)]/(對照組OD值-空白組OD值)×100％。以上步驟重復(fù)3次。1.2.3DNA瓊脂糖凝膠電泳取對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞消化傳代后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為4uku·ml-1蚯蚓纖溶酶，對照組加入等體積的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后，1000r·min-1離心5min。沉淀細(xì)胞加入1×STE緩沖液（含10mmol·L-1TrisHCl，10mmol·L-1NaCl，1mmol·L-1EDTA，

7、pH8.0）0.6ml，10％SDS10μl，20mg·ml-1蛋白酶K10μl，混勻，37℃水浴過夜；次日加入氯仿0.8ml，混勻，37℃水浴過夜；次日再次加入氯仿0.8ml，混勻，室溫以8944r·min-1離心10min，吸取上清，加入無水乙醇1.5ml，混勻，室溫以8944r·min-1離心10min，棄上清，倒置EP管，干燥，加水50μl重溶DNA，室溫放置30min以上，取6μlDNA，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯狀條帶。1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞加入終濃度分別為2、4、8uku·ml-1的蚯蚓纖

8、溶酶為實(shí)驗(yàn)組，對照組加入等體積的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，收集各組細(xì)胞，每組細(xì)胞3個樣本。4℃，1000r·min-1離心