雄黃抑制宮頸癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外研究

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1、雄黃抑制宮頸癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外研究作者：尹伶濮德敏吳青郭孝鵬【摘要】　　目的：體外研究中藥雄黃主要成分As4S4對(duì)子宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。方法：以As4S4不同濃度(7.5、15、30、60mg/L)，分12h,24h,36h,48h,60h處理Hela細(xì)胞,用光鏡觀察細(xì)胞變化；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；用DNA梯狀電泳(DNAladder)檢測(cè)凋亡的發(fā)生。結(jié)果：不同濃度(7.5、15、30、60mg/L)的As4S4處理的Hela細(xì)胞,細(xì)胞增殖受到抑制，作用呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系，差異有非常

2、顯著性(P<0.01)；As4S4誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡率為(8.13±1.13)%～(62.36±4.42)%,與對(duì)照組比較(2.84±1.88)%,差異有極顯著性(P<0.01),并呈濃度依賴性；DNAladder呈梯狀條帶。結(jié)論：雄黃體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用?！娟P(guān)鍵詞】As4S4；增殖抑制;Hela細(xì)胞;凋亡　　祖國(guó)的傳統(tǒng)中藥雄黃是砷劑的一種，主要成分為硫化砷(As4S4)，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有悠久的應(yīng)用歷史。近來(lái)中藥砷劑(雄黃、砒霜)在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)方面取得了明顯的療效［1～3］，發(fā)現(xiàn)中藥砷劑具有抗腫瘤作用，其主要機(jī)制

3、是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前對(duì)氧化砷（砒霜）的研究較為廣泛,而對(duì)硫化砷雄黃研究的報(bào)道較少，對(duì)婦科腫瘤的作用未見報(bào)道?！　∽訉m頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,由于近年來(lái)性傳播疾病的蔓延,宮頸癌的發(fā)病率又有上升和年輕化趨勢(shì)。目前治療宮頸癌以手術(shù)為主,但根治術(shù)的5年生存率較低,子宮頸癌對(duì)放療的敏感性具有個(gè)體差異,且放療后易出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),因此尋找有效的子宮頸癌化療藥物具有重要意義。本研究對(duì)雄黃的主要成分硫化砷對(duì)人子宮頸癌Hela細(xì)胞體外作用進(jìn)行了探討,旨在為尋找新的有效治療子宮頸癌的藥物提供理論依據(jù)?！　?材料和方法　　1.1材料　　人宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自上?？茖W(xué)院生物細(xì)胞研究所。高純度雄黃

4、As4S4（>95%）由西安交通大學(xué)血液病研究中心提純惠贈(zèng)。5%四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT溶液,上海華美生物工程公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、DNALadder試劑盒(美國(guó)Sigma公司);胰蛋白酶、RMPI1640培養(yǎng)基、小牛血清(武漢凌飛生物公司)。　　1.2細(xì)胞形態(tài)觀察　　每瓶(25cm2)接種1.5×105細(xì)胞,24ｈ后加入不同濃度(7.5、15、30、60mg/L)的As4S4處理,每天用倒置顯微鏡觀察記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化?！　?.3MTT檢測(cè)　　以每孔1×105個(gè)Hela細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,分為空白組(調(diào)零)、As4S4實(shí)驗(yàn)組(7.5、15

5、、30、60mg/Lmg/L)和對(duì)照組(不加藥物的細(xì)胞)，分別培養(yǎng)12h,24h,36h,48h,60h后加入MTT液，再培養(yǎng)4h，吸棄孔中的培養(yǎng)上清,每孔加入150μlDMSO,混勻10min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析儀570nm處測(cè)定各孔吸光度值(A),抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。重復(fù)3次取平均值?！　?.4DNA梯狀電泳(DNAladder)　　培養(yǎng)細(xì)胞離心換液后,經(jīng)冷PBS洗2遍,按照試劑盒說(shuō)明提取DNA,并溶于無(wú)DNA酶的TE液中,20V電泳4h瓊脂糖凝膠電泳后,KODAKDNAanalysis2.0凝膠成像系統(tǒng)分析?！　?.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋

6、亡率　　用AnnexinVFITC及PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為7.5、15、30、60mg/L的As4S4作用24h，未加藥組為對(duì)照組，用70%乙醇4℃固定24h，PBS緩沖液洗去固定液，離心去上清。用緩沖液37℃孵育60min，195μl細(xì)胞懸液加5μlAnnexinVFITC，混勻，室溫10min。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次，在190μl緩沖液中重懸，然后再加10μl(含20μg)碘化丙啶，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)?！　?.6統(tǒng)計(jì)分析　　采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，ANOVA分析?！　?結(jié)果　　2.1光鏡下Hela細(xì)胞凋

7、亡的形態(tài)學(xué)變化　　正常生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，粘附生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶壁上，細(xì)胞平坦?！　s4S4處理Hela細(xì)胞24h,7.5mg/L處理組可見細(xì)胞間有間隙，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；15mg/L處理組可見細(xì)胞變圓,體積縮?。?0mg/L處理組可見細(xì)胞間距離增大，圓細(xì)胞增多，細(xì)胞皺縮，核固縮出現(xiàn),核顏色加深,折光性增強(qiáng)；60mg/L處理組可見細(xì)胞脫落懸浮在培養(yǎng)基中。隨著As4S4作用時(shí)間增加，以上變化更明顯，至60h，細(xì)胞壞死。對(duì)照組