高氧性肺損傷中mapk信號途徑的表達及其作用機制論文

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1、高氧性肺損傷中MAPK信號途徑的表達及其作用機制論文【摘要】目的：探討絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路三亞族ERK，p38，JNK在大鼠高氧性肺損傷動物模型中的表達及作用.方法：24只3周齡APK)信號轉導途徑與多種氧化應激性疾病密切相關［2-3］.我們以幼年APK信號通路中3個主要亞族成員細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK），cJun氨基末端激酶/應激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK）,p38激酶在不同高氧暴露時間段肺組織的分布以及蛋

2、白表達，并分析MAPK信號轉導途徑與高氧肺損傷的關系.1材料和方法1.1材料3周齡APK抗體的分布，其余部分置于-70℃冰箱保存，行phosphop44/p42，p38，SAPK/JNKAPK在肺組織中的分布切片脫蠟至水，30mL/LH2O2封閉內源性過氧化物酶5～10min，熱修復抗原，血清封閉20min，滴加一抗，分別為磷酸化ERK多克隆抗體（1∶250），磷酸化p38多克隆抗體（1∶1000），磷酸化JNK多克隆抗體（1∶100），4℃過夜.二抗為HRP標記山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃20min孵育.DAB

3、顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片.結果判斷：胞核和/或胞質呈現(xiàn)棕黃色為陽性細胞.1.2.4肺組織胞漿蛋白提取和定量滴加液氮于研缽粉碎組織塊，加入改良RIPA緩沖液（TrisHCl50mmol/L，NaCl150mmol/L,EDTA1mmol/L,NaF50mmol/L,Na4P2O72.5mmol/L，Na3VO41mmol/L，TritonX10010mL/L，甘油100mL/L，SDS1g/L，脫氧膽酸鈉5g/L，leupetin100umol/L，PMSF1mmol/L.每100mg組織加入0.5mLRIP

4、A裂解液，充分勻漿，冰浴作用30min,4℃12879g離心30min.此操作過程均在冰上進行以防止蛋白降解.取上層液體-20℃保存.用BCA比色法測定蛋白質濃度.1.2.5磷酸化ERK，p38，JNK蛋白含量檢測用APK蛋白在肺組織的分布空氣對照組偶有少量磷酸化ERK，p38，JNK陽性表達，主要見于肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞，高氧暴露組則陽性細胞明顯增多，廣泛分布肺泡上皮細胞、氣道上皮細胞、胸膜間皮細胞以及浸潤炎癥細胞、支氣管黏膜下水腫間質的纖維細胞.p38尤其高表達于大量浸潤炎性細胞.三種MAPK蛋白表達的細胞類型基本

5、相同(圖1).2.3肺組織磷酸化ERK/p38/JNK蛋白含量變化與空氣對照組比較，各高氧暴露組ERK/p38/JNK蛋白表達明顯增強.phosphoERK，phosphoSAPK/JNK在高氧暴露7d組表達最為明顯（P﹤0.05），phosphop38在高氧暴露14d組表達最為明顯（P0.05，圖2，表1）.表1各組肺組織MAPK蛋白含量相對變化（/GAPDH）（略）3討論MAPK是一類絲－蘇氨酸激酶家族，能介導大量細胞外應激的細胞反應，如炎癥細胞因子、熱休克、紫外線照射、機械牽張刺激、滲透壓應激等［4-6］.MAP

6、K家族最重要的3個亞族中，p38和JNK屬于“應激誘導”的MAPK，而ERK被認為是與細胞增殖、轉化和分化相關的MAPK.免疫組化顯示ERK，JNK，p38在空氣對照組僅少量表達于肺泡上皮細胞及氣道黏膜上皮，高氧刺激后上述MAPK家族成員被激活，且肺內多類細胞參與了此種過程，除肺泡上皮、氣道上皮外，還包括浸潤炎癥細胞、胸膜間皮細胞、間質纖維細胞，尤其p38陽性表達顯著見于單核細胞、內皮細胞和中性粒細胞等炎性細胞內，這與之前研究發(fā)現(xiàn)p38的激活主要見于炎癥反應相吻合，進一步提示了p38是MAPK家族參與炎癥反應最重要的成員［7

7、-9］.近年發(fā)現(xiàn)在許多細胞體系中，活性氧自由基（reactiveoxygenspecies,ROS）能激活MAPK通路而調控細胞的增殖、分化、生存及凋亡［10-11］，但是在不同的細胞，不同的刺激模型，氧化應激激活MAPK的報道不盡相同.Han等［12］從高氧暴露的大鼠肺組織懸液收集培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細胞，發(fā)現(xiàn)ERK被激活而p38，JNK活性卻無明顯改變.而用于生成胞內超氧陰離子的吩嗪硫酸甲酯能激活倉鼠肺成纖維細胞（V79）JNK以及p38,卻對ERK1/2無活化作用［13］.本研究發(fā)現(xiàn)，在高氧暴露3d時，即可檢測到有明顯的J

8、NK活性增加；在發(fā)生急性肺水腫最顯著的高氧暴露7d組，ERK及JNK的活性表達最強，而p38最強表達則在有纖維化表現(xiàn)的高氧暴露14d組.Carvalho等［14］給予原代肺泡Ⅱ型上皮細胞H2O2刺激，ERK，JNK，p38亞族均被激活，也發(fā)現(xiàn)它們激活的時間顯著不一致，說明ROS激活MAPK