高氧性肺損傷中mapk信號途徑的表達及其作用機制

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1、高氧性肺損傷中MAPK信號途徑的表達及其作用機制【摘要】目的：探討絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路三亞族ERK，p38，JNK在大鼠高氧性肺損傷動物模型中的表達及作用.方法：24只3周齡APK蛋白表達變化.結(jié)果：高氧暴露3，7d組出現(xiàn)急性肺損傷的典型病理學特征，高氧暴露14d組肺間質(zhì)及纖維細胞增生明顯.免疫組化顯示空氣對照組僅肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞見少量磷酸化ERK，p38，JNK陽性表達，高氧暴露組則陽性細胞明顯增多，廣泛分布于肺內(nèi)細胞中：肺泡上皮細胞、氣道上皮細胞、胸膜間皮細胞、浸潤炎細胞及間質(zhì)纖維細胞,p38

2、陽性表達尤多見于炎性細胞中.APK信號途徑，磷酸化ERK，p38，JNK在高氧損傷肺組織表達明顯增加，MAPK三亞族ERK，p38，JNK活性變化在時間上并不具有同步性.【關(guān)鍵詞】高氧癥；急性??；肺/損傷；MAP激酶信號系統(tǒng)；ROS　　氧療是治療新生兒呼吸窘迫綜合癥的有效方法之一，但長時間暴露在高氧狀態(tài)下會導致肺上皮細胞死亡、急性肺損傷甚至呼吸功能衰竭〔1〕.盡管高氧介導的肺損傷機制目前尚不完全清楚，但已經(jīng)證實絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPK)信號轉(zhuǎn)導途徑與多種氧化應

3、激性疾病密切相關(guān)〔2-3〕.我們以幼年APK信號通路中3個主要亞族成員細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK），cJun氨基末端激酶/應激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK）,p38激酶在不同高氧暴露時間段肺組織的分布以及蛋白表達，并分析MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑與高氧肺損傷的關(guān)系.　　1材料和方法　　1.1材料　　3周齡APK抗體的分布，其余部分置于-70℃冰箱保存，行phosphop44/p42，p38，SAPK/JNKAPK在肺組織中的分布切片脫

4、蠟至水，30mL/LH2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶5～10min，熱修復抗原，血清封閉20min，滴加一抗，分別為磷酸化ERK多克隆抗體（1∶250），磷酸化p38多克隆抗體（1∶1000），磷酸化JNK多克隆抗體（1∶100），4℃過夜.二抗為HRP標記山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃20min孵育.DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片.結(jié)果判斷：胞核和/或胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色為陽性細胞.　　1.2.4肺組織胞漿蛋白提取和定量　　滴加液氮于研缽粉碎組織塊，加入改良RIPA緩沖液（TrisHCl50mmol/L，Na

5、Cl150mmol/L,EDTA1mmol/L,NaF50mmol/L,Na4P2O72.5mmol/L，Na3VO41mmol/L，TritonX10010mL/L，甘油100mL/L，SDS1g/L，脫氧膽酸鈉5g/L，leupetin100umol/L，PMSF1mmol/L.每100mg組織加入0.5mLRIPA裂解液，充分勻漿，冰浴作用30min,4℃12879g離心30min.此操作過程均在冰上進行以防止蛋白降解.取上層液體-20℃保存.用BCA比色法測定蛋白質(zhì)濃度.　　1.2.5磷酸化ERK，p38，JNK蛋

6、白含量檢測　　用in，用QuantityoneChemiDocXRS圖像采集系統(tǒng)及分析軟件（美國BioRad公司）對蛋白條帶進行分析處理,蛋白含量用目的條帶校正容積（Adjvolume）/GAPDH校正容積（Adjvolume）表示.　　統(tǒng)計學處理：計量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.5分析軟件多組間比較用單因素方差分析，兩兩組間差別比較采用LSDt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.　　2結(jié)果　　2.1肺組織病理學觀察　　空氣對照組肺組織肉眼觀無明顯異常.高氧暴露3和7d組肺組織體積增大，表面點狀或斑片狀出血，切

7、面見液體流出，呈充血水腫狀；光鏡見肺泡上皮細胞腫脹，肺泡腔和肺間質(zhì)水腫，炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，尤以高氧暴露7d組更明顯.高氧暴露14d組肺組織體積較3和7d組略小，肺表面見斑片狀改變，光鏡下肺泡上皮水腫減輕，炎性滲出減少，肺間質(zhì)及纖維細胞增生明顯.　　2.2磷酸化MAPK蛋白在肺組織的分布　　空氣對照組偶有少量磷酸化ERK，p38，JNK陽性表達，主要見于肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞，高氧暴露組則陽性細胞明顯增多，廣泛分布肺泡上皮細胞、氣道上皮細胞、胸膜間皮細胞以及浸潤炎癥細胞、支氣管黏膜下水腫間質(zhì)的纖維細胞.p38尤其

8、高表達于大量浸潤炎性細胞.三種MAPK蛋白表達的細胞類型基本相同(圖1).　　2.3肺組織磷酸化ERK/p38/JNK蛋白含量變化　　與空氣對照組比較，各高氧暴露組ERK/p38/JNK蛋白表達明顯增強.phosphoERK，phosphoSAPK/JNK在高氧暴露7d組表達最為明顯（