水通道蛋白4在急性實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷中的表達(dá)論文

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1、水通道蛋白4在急性實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷中的表達(dá)論文.freelRNA的表達(dá)變化。結(jié)果脊髓損傷后AQP4及其mRNA表達(dá)即開(kāi)始增加并持續(xù)上升，傷后3d達(dá)到高峰，以后逐漸減少，二者的表達(dá)變化呈顯著正相關(guān)。結(jié)論AQP4參與了脊髓損傷后水腫的形成過(guò)程，AQP4過(guò)度表達(dá)可能是損傷性脊髓水腫的分子生物學(xué)機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】水通道蛋白4；免疫組化RTPCR；脊髓損傷；脊髓水腫急性脊髓損傷(acutespinalcordinjury，ASCI)臨床上常見(jiàn).freelRNA的表達(dá)變化規(guī)律，并對(duì)脊髓損傷后AQP4的表達(dá)與脊髓水腫的相關(guān)性進(jìn)行分析，

2、進(jìn)一步探討損傷性脊髓水腫的分子生物學(xué)機(jī)制。1材料與方法1.1材料4～5個(gè)月齡健康雄性新西蘭大耳白兔48只，體重2.1～3.2kg，平均2.7kg。根據(jù)脊髓損傷造模成功后6h、1、3、5、7d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)1～5組以及對(duì)照組，每組平均8只。主要試劑：抗兔AQP4抗體(博士德)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒及DAB濃縮顯色液(邁新)。1.2方法1.2.1建立急性不完全性脊髓損傷模型3%戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉。咬除兔T12棘突和椎板修剪成直徑約0.4cm的圓形骨窗，顯露脊髓，在硬膜表面放置與骨窗直徑一致的塑料墊片，用

3、自制的改良Allen裝置制備脊髓損傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組參照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果從3cm高處擊打，致傷能量60gcm。造模成功標(biāo)志：實(shí)驗(yàn)兔雙后肢抽動(dòng)后弛緩癱。對(duì)照組只暴露脊髓節(jié)段，不打擊脊髓。1.2.2脊髓標(biāo)本的采取實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按照分組時(shí)間點(diǎn)、對(duì)照組動(dòng)物于術(shù)后3d分別處死，以骨窗為中心，切取1.0cm的脊髓段。將脊髓標(biāo)本從中心點(diǎn)一分為二，一半于－70℃低溫保存，備RTPCR之用；另一半于4%多聚甲醛固定液中固定24h后用蒸餾水清洗12h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、4μm連續(xù)切片行免疫組織化學(xué)染色。1.2.3脊髓損傷不同時(shí)段AQ

4、P4的表達(dá)切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫浸泡10min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗，PBS洗；滴加正常血清封閉20min，棄血清，直接加一抗，室溫下孵育過(guò)夜，PBS充分洗；滴加二抗室溫下30min，PBS充分洗；DAB顯色鏡下控制，自來(lái)水充分洗；蘇木素染核，脫水透明，封片光鏡觀(guān)察。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：取相同量的正常血清代替AQP4抗體，其余步驟同前。光鏡下細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為AQP4免疫陽(yáng)性細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察切片，每只兔共染色3張切片，隨機(jī)選擇4處灰白質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，用圖像分析儀測(cè)量脊髓損傷不同時(shí)段平均光密度(OD)值，3

5、張切片的均值為該只兔脊髓AQP4表達(dá)的OD值。1.2.4RTPCR檢測(cè)脊髓損傷不同時(shí)段AQP4mRNA的表達(dá)不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脊髓組織各50mg進(jìn)行RTPCR分析，按Trizol試劑說(shuō)明提取組織總RNA；采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照基因庫(kù)基因序列設(shè)計(jì)引物，AQP4引物上游序列5′TTGGACCATCATAGGCGC3′，下游序列5′GCATGTGATCGACATTGACC3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約214bp；GAPDH引物上游引物5′GGGTGATGCTGGTGCTGAG

6、TATGT3′，下游序列5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約700bp。RTPCR引物由聯(lián)星公司合成。擴(kuò)增條件：94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后，接72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀(guān)察并照相。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用t檢驗(yàn)分析，并分別對(duì)脊髓損傷不同時(shí)段AQP4染色表達(dá)OD值、AQP4mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。2結(jié)果2.1

7、損傷脊髓的表達(dá)對(duì)照組脊髓AQP4在灰質(zhì)和白質(zhì)均有表達(dá)。脊髓灰質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞膜呈棕黃色，順中央管排列的室管膜細(xì)胞表達(dá)呈弱陽(yáng)性，中央管室管膜周?chē)⒀苤車(chē)磉_(dá)強(qiáng)烈，鄰近毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元的膠質(zhì)細(xì)胞突起表達(dá)亦非常豐富，神經(jīng)元未見(jiàn)著色。脊髓白質(zhì)內(nèi)的纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞、脊髓表面軟脊膜也呈陽(yáng)性表達(dá)，以鄰近蛛網(wǎng)膜下腔和面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)得更加突出。損傷早期中央管周?chē)秃蠼侨旧^深，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)損傷部位及其周?chē)乃[區(qū)AQP4表達(dá)明顯增強(qiáng)，而脊髓中央出現(xiàn)壞死、空泡形成的區(qū)域反而表達(dá)減弱，甚至無(wú)表

8、達(dá)。實(shí)驗(yàn)1組，AQP4表達(dá)開(kāi)始增加。實(shí)驗(yàn)3組，AQP4表達(dá)在損傷脊髓的水腫區(qū)達(dá)高峰，尤其在血管周?chē)磉_(dá)強(qiáng)烈，呈深棕色。隨時(shí)間延長(zhǎng)AQP4表達(dá)又逐漸減弱，實(shí)驗(yàn)5組表達(dá)仍稍高于正常水平。AQP4陽(yáng)性表達(dá)主要位于損傷周?chē)[區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而胞漿及胞核未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，鏡下AQP4陽(yáng)性細(xì)胞呈空泡狀。2.