[理學(xué)]纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選分離

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1、纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選分離一、實驗?zāi)康模?.掌握無菌操作的技術(shù)2.掌握選擇培養(yǎng)基的設(shè)計和配制3.掌握特定菌種篩選方法4.掌握菌種鑒定方法5.測定菌種生長曲線和纖維素酶的活性二、實驗原理：該研究設(shè)計性實驗是利用纖維素酶產(chǎn)生菌可以分解纖維素酶，故而在含有羧甲基纖維素的平板（pH9.0）上可形成透明圈的原理和篩選纖維素酶產(chǎn)生菌。三、實驗內(nèi)容：(1)培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基的配制同體培養(yǎng)基：250mL三角瓶、1.8g營養(yǎng)肉湯、100mL水、pH9.0、2gCNC-Na、2g瓊脂、攪拌均勻包扎滅菌液體培養(yǎng)基：250mL三角瓶、1.8g營養(yǎng)肉湯、100mL水、pH9.0、2gCNC-Na、2g瓊脂、攪拌均勻包扎

2、滅菌（配制2份備用）①搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配制蛋白胨1.0%、酵母粉1.0%、CMC-Na1.0%、NaCL0.5%、KH2PO40.1%，另配10%NaCO3，分開滅菌后與上述培養(yǎng)基成分按1:9的比例混合均勻，使培養(yǎng)基的初始PH為9.5-10（2）配制篩選平板和斜面培養(yǎng)基在超凈臺中將上述培養(yǎng)基倒入平板和試管，試管傾斜放置，待培養(yǎng)基凝固后，低溫保存，待用。（3）菌種篩選①稱取土樣10g，用無菌水稀釋定容至100mL，將土壤液稀釋至移取150mL土壤懸液到篩選平板A，均勻涂布后于30。C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h.②待平板A長出單菌落后，用接種環(huán)挑取每個單菌落的一半到另一篩選平板C上，作染色鑒定，原來平

3、板B保存于4。C的冰箱中，保藏備用②將用于染色鑒定的篩選平板C于30。C恒溫培養(yǎng)1-2d，向培養(yǎng)皿中加入適量1mg/mLa的剛果紅溶液，并染色1h;棄去染液，加入適量1mol/L的NaCla溶液，洗滌1h，若細菌產(chǎn)生纖維素酶，則在菌落的周圍會出現(xiàn)清晰的透明圈，依據(jù)透明圈的直徑大小選擇產(chǎn)生酶菌株。①將純化的產(chǎn)纖維素酶菌株接種到斜面培養(yǎng)，待用。（4）生長曲線的測定流程種子液→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→測定①種子液制備取大腸桿菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，靜止培養(yǎng)12h作種子培養(yǎng)液②標(biāo)記編碼取盛有50mL無菌肉膏蛋白胨培養(yǎng)液250mL三角瓶11個，分別標(biāo)號為0、1.5、3

4、、4、6、8、10、12、14、16、20h③接種培養(yǎng)用2mL無菌吸管分別準(zhǔn)確吸取2mL種子液加入已編號的11個三角瓶中，于37。C下震蕩培養(yǎng)。然后分別按對應(yīng)時間將三角瓶取出，測OD值④生長量測定將未接種的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調(diào)節(jié)零點，作為空白對照，并對不同時間培養(yǎng)液從Oh起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在0.10～0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。①結(jié)果將測定的OD值填入下表時間（h）對照01.534681012141620光密度值（OD600）以上述表

5、格中的時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線。（5）發(fā)酵產(chǎn)酶①將經(jīng)篩選的單菌落有斜面培養(yǎng)基接種到30mL(205mL的三角瓶)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床37。C，225rpm下培養(yǎng)48h，制成液體菌種。②然后按1%的接種量將液體菌種加入到50mL(250mL的三角瓶)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床床37。C，225rpm下進行發(fā)酵。①取培養(yǎng)適當(dāng)時間（具體根據(jù)生長曲線制定）的發(fā)酵液在高速離心機中進行4。C，8000rpm離心10min，上清液即為粗酶液。（6）酶活性測定（與測生長曲線可以同步進行）①標(biāo)注曲線的繪制（根據(jù)實際測定的酶液吸光值，對應(yīng)該曲線可以查出相應(yīng)的酶活力）分別吸取0

6、.5%標(biāo)準(zhǔn)葡萄溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別定容至50mL。再分別吸取上述溶液各1.5mL于比色管中，各加1.5mL3,5一二硝基水楊酸溶液，煮沸5min（另作1管對照，取1.5mL蒸餾水，加1.5mL3,5一二硝基水楊酸溶液，同樣煮沸5min。冷卻后，用分光光度計在540nm波長下比色，以光密度做縱坐標(biāo)，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液含糖的毫摩爾數(shù)（酶活力）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②取菌液在8000r/m下離心10min，得到的上清液為酶液。①取0.1mL酶液（另取0.1毫升酶液在沸水浴中煮20min滅活對照），加入1mLpH=8.04的1%CMC-Na溶液，置于55。C中恒溫

7、反應(yīng)30分鐘然后加入1Mldns,在沸水浴中顯色10分鐘，再加入2毫升水，測540nm吸光度（以滅活的的酶液經(jīng)同樣操作后作為對照）。用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)液以每小時生成相當(dāng)于1mg葡萄糖作為一個活力單位U。（7）菌種鑒定取篩選平板C的單個菌落，在載玻片上進行革蘭氏染色鑒定觀察。（8）菌種保存①無菌甘油制備將適量的60%的甘油置于三角瓶中，外加封口膜，121。C，高壓蒸汽滅菌20分鐘后，備用。②菌懸液的制備將菌種培養(yǎng)液