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1、LMO3mRNA在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)論文惠玲，蔡文琴，紀(jì)華，呂同德，楊金升，趙治華【關(guān)鍵詞】LMO3；原位雜交組織化學(xué)；小鼠；腦【Abstract】AIM:ToexaminethelocalizationofneuronalspecifictranscriptionfactorLMO3mRNAinthedevelopmentofcentralnervoussystem(S)ofthemice.METHODS:RealtimefluorescencequantitativeRTPCR(FQRTPCR)andinsituhybridizationhistochemicalstaini
2、ngmethodRNA.RESULTS:TheFQRTPCRshoRNAostremainedthesameleveluntiladult.LMO3mRNAexpressionbryonicstages(E10.511.5d),butnotdetectedatotherpartsofembryo.Thehighlevelinbrainid(E15.5d)andlate(E17.5P0d)embryonicbrainandshoent,LMO3mRNARNAexpressionofP14P60doreregionalthanthatofP7d.ThesignalofLMO3mRNAai
3、nlylocatedindifferentnucleusclonyandshoentduringembryonicperiodandpostnataldifferentiationandspecificationofspecificbrainregions.【Keyistry;mice;brain【摘要】目的：研究不同發(fā)育時(shí)期小鼠腦內(nèi)LMO3的表達(dá).方法：采用以SYBRGreenI為熒光染料的定量RTPCR及以地高辛標(biāo)記的cRNA為探針的原位雜交組織化學(xué)法檢測(cè)LMO3基因在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá).結(jié)果：FQRTPCR結(jié)果表明，LMO3在出生前高表達(dá)，P7d后表達(dá)水平急劇下降.free
4、lRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表達(dá)，但僅限于整個(gè)腦泡組織內(nèi)，胚體其他區(qū)域均為陰性；E11.5d腦區(qū)信號(hào)逐漸加強(qiáng)，無(wú)核團(tuán)及腦區(qū)的特異性，胚體其他部分仍為陰性；E15.5～P0d期LMO3陽(yáng)性信號(hào)在幾乎所有觀察的腦區(qū)均有廣泛而較強(qiáng)的著色；P7dLMO3陽(yáng)性信號(hào)較出生前變?nèi)?，分布逐漸集中；P14～P60dLMO3mRNA表達(dá)范圍較P7d逐漸縮小，但仍有廣泛表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)主要集中于不同核團(tuán)，表達(dá)有強(qiáng)弱之分.結(jié)論：LMO3基因可能與小鼠出生前腦的發(fā)育以及出生后特定腦區(qū)神經(jīng)元的特化及特性維持有關(guān).【關(guān)鍵詞】LMO3；原位雜交組織化學(xué)；小鼠；腦0引言多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子DAT1(GenBank
5、登錄號(hào)：AF258348)又稱LMO3，是我們獲得的星形膠質(zhì)細(xì)胞在DA作用下發(fā)生反應(yīng)性變化時(shí)上調(diào)表達(dá)的基因之一［1］.LMO家族由4個(gè)成員組成，即LMO1～LMO4.我們以往的研究證實(shí)LMO3mRNA在成年大鼠和小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（S）中分布廣泛，提示LMO3基因在S有重要作用［2］.本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法及原位雜交組織化學(xué)的方法對(duì)LMO3mRNA在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，以探討LMO3在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用.1材料和方法1.1材料成年昆明種雌雄小鼠由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.于每日18：00按雌雄1∶1合籠，次日晨取出，檢查雌鼠的陰道口有無(wú)陰栓，有陰栓者既定
6、為孕期0d(E0d)，出生當(dāng)日為生后1d(P0)，依此類推.分別取E10.5，E11.5,E15.5，E17.5，P0，P7，P14，P30，P60d的小鼠，每組5只，進(jìn)行原位雜交檢測(cè)并提取總RNA后用于熒光定量RTPCR試驗(yàn).地高辛標(biāo)記小鼠LMO3cRNA寡聚核苷酸探針由湖北武漢博士德公司合成.1.2方法1.2.1熒光定量RTPCR采用Tri201試劑提取制備總RNA，測(cè)定A260nm對(duì)RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量.取2μg總RNA，經(jīng)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，熒光介質(zhì)選用SYBRGreenI，根據(jù)同時(shí)擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各樣本的初始拷貝數(shù)，
7、結(jié)果以LMO3copies/G3PDHcopies表示LMO3mRNA在各組起始RNA中的相對(duì)含量.在PCR后進(jìn)行融解曲線分析以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物，溫度以0.2℃/s的速率從55℃緩慢遞增到100℃.同時(shí)將反應(yīng)產(chǎn)物置20g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性.1.2.2原位雜交組織化學(xué)全胚胎原位雜交新鮮取材的鼠胚(E10.511.5)用PBS洗2次，入4%多聚甲醛固定過(guò)夜，PBT洗2次后，用250mL/L甲醇PBT,500mL/L甲醇PB
