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1、妍婷顆粒對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL【摘要】 目的研究中藥復(fù)方妍婷顆粒對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-1β（IL-1β）的影響，初步探討妍婷顆粒對慢性盆腔炎免疫調(diào)節(jié)的內(nèi)在機(jī)制。方法對經(jīng)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞給予不同濃度妍婷顆粒含藥血清進(jìn)行干預(yù)，用ELISA法檢測上清液中IL-1β含量，用RT-PCR法檢測細(xì)胞中IL-1βmRNA的表達(dá)。結(jié)果①正常小鼠脾細(xì)胞合成和分泌少量IL-1β，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后IL-1β分泌量明顯升高（P<0.01），IL-1βmRNA表達(dá)增強(qiáng)。②不同濃度妍婷顆粒干預(yù)呈劑量依賴方式降低LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞IL-1β
2、的分泌量與表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論妍婷顆粒具有抑制LPS刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的作用，據(jù)此推測妍婷顆?？寡?、免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理可能與其抑制脂多糖介導(dǎo)的IL-1β釋放有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】妍婷顆粒脂多糖小鼠脾細(xì)胞白介素-1β 妍婷顆粒方為導(dǎo)師侯麗輝教授多年臨床經(jīng)驗與中醫(yī)理論相結(jié)合，總結(jié)出的治療慢性盆腔炎的經(jīng)驗方，已在臨床廣泛應(yīng)用多年，且療效顯著。慢性盆腔炎是婦科常見病、多發(fā)病，有纏綿不愈、易于復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，近年其發(fā)病率呈上升趨勢，因此對慢性盆腔炎的認(rèn)識與研究日益廣泛和深入。IL-1具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)、致熱、介導(dǎo)炎癥等作用，是慢性盆腔炎發(fā)生發(fā)展的一種重要
3、細(xì)胞因子。本研究觀測妍婷顆粒對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響，從分子免疫學(xué)角度探討妍婷顆粒治療慢性盆腔炎的機(jī)理和有效性?！ ?器材 1.1儀器與試劑超凈工作臺（蘇州凈化），二氧化碳培養(yǎng)箱（SHEL·LAB），臺式高速離心機(jī)(BECKMAN)，電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特），AB204型電子天平(Sartorius)，磁力加熱攪拌器78-1（江蘇金壇），雙蒸水餾器(MILLI-Q)，752型分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），PCR儀(Eppendorf),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）?！ 「牧夹蚏PMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone)
4、，胎牛血清（杭州四季青），D-PBS（北京中山金橋），LPS(Sigma)，Trizol(Lnvitrogen),引物(Sangon),氯仿（天津市天大化學(xué)試劑廠），異丙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），瓊脂糖(Solarbio)，PCR所需試劑購自Promega及TakaRa公司，ELISA試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）?！ ?.2動物6～8周齡昆明雌性小鼠，體重20～25g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供?！ ?.3藥物妍婷顆粒方組成：丹參、赤芍、元胡、三棱、莪術(shù)、紅藤、敗醬草、皂刺、川楝子。藥物來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，制成
5、中藥顆粒劑，蒸餾水溶解，最后濃縮含生藥濃度為1.75g/ml?！ ?方法 2.1含藥血清的制備取體重20～25g的正常昆明雌性小鼠，按人鼠體重比換算后，以妍婷顆粒方灌胃（20ml/kg，約相當(dāng)于成人用量的7倍），2次/d，連續(xù)3d，最后1次給藥后2h，頸動脈取血，以2000r/min離心5min，分離血清，并于57℃滅活（30min），－20℃凍存?zhèn)溆茫?］?！ ?.2小鼠脾細(xì)胞的分離培養(yǎng)小鼠頸椎脫位處死，置75%乙醇中浸泡3～5min，仰臥位，無菌取脾臟，用D-PBS液沖洗，置于平皿中，移入超凈工作臺，再以濾過的D-PBS快速、充分洗滌后，置于燒杯上的
6、200目不銹鋼網(wǎng)，將脾組織用眼科剪剪成小塊，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮狀，D-PBS液沖洗過濾脾細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液無菌離心管中，1500r/min離心10min，使細(xì)胞沉淀，棄上清，再以D-PBS液洗滌細(xì)胞2次，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次(均以1500r/min離心10min)。以RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，含有青霉素、鏈霉素各100u/ml）懸浮細(xì)胞，0.4%臺盼藍(lán)染色顯示活力，細(xì)胞存活數(shù)大于90%，調(diào)整細(xì)胞密度，按1×106/ml密度接種細(xì)胞，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h后加LPS及不同濃度妍婷顆粒進(jìn)行干預(yù)
7、（LPS濃度為10μg／ml［2］；妍婷顆粒濃度分別為培養(yǎng)基的5%，10%，20%［1］）?！ ?.3實驗分組實驗分組為正常組；LPS處理組（10μg／ml）；5%妍婷顆粒＋LPS處理組；10%妍婷顆粒＋LPS處理組；20%妍婷顆粒＋LPS處理組?！ ?.4實驗檢測給予LPS及妍婷顆粒干預(yù)24h［3］后收集上清及細(xì)胞?！ ?.4.1培養(yǎng)液上清中IL-1β含量測定收集上清液－20℃冰箱保存，按ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測?！ ?.4.2RT-PCR法檢測細(xì)胞中IL-1βmRNA的表達(dá)用Trizol提取細(xì)胞總RNA,測總RNA純度和含量,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,IL
8、-1β的上游引物為:5＇-AGGCTCCGAGATGAACAA-3
