外源性人afgf在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的分泌論文

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1、外源性人aFGF在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的分泌論文.freelL含100mL/LFCS的DMEM培養(yǎng)液,37℃、50mL/LCO2,培養(yǎng)24h。吸出6孔板中培養(yǎng)液,按1mL/孔將倍比稀釋的病毒液加到6孔板中,細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1h后,每孔加入1mL含100mL/LFCS的DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.3AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞將EPC分成3組,按1×105個(gè)/孔接種到6孔板中。分別用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC,未感染的EPC作為對照,標(biāo)記為spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC。培養(yǎng)液為含50mL/L胎牛血清的EGM2,在37℃、50

2、mL/LCO2中培養(yǎng)24h。用PBS液洗滌細(xì)胞3次,徹底洗去血清成分。在試管中將200μLAAV濃縮液與1mL無血清的EBM2混合,加入到每孔細(xì)胞中。分別標(biāo)記為“EPCspaFGF”,“EPChrGFP”和“EPC”。將細(xì)胞置于37℃、50mL/LCO2中培養(yǎng)2h,期間每隔15min轉(zhuǎn)動1次培養(yǎng)板,保證病毒液與細(xì)胞充分接觸。2h后用1mL含50mL/L胎牛血清的EGM2代替無血清的EBM2,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.4檢測細(xì)胞分泌的aFGF蛋白收集spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC3組細(xì)胞培養(yǎng)液,離心后,取上清液,用ELIS

3、A試劑盒檢測其中的人aFGF蛋白。取樣品與倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各01mL加入已包被抗人aFGF抗體的酶標(biāo)板中,一孔加樣品稀釋液作為0孔,加蓋。37℃反應(yīng)120min。反應(yīng)后甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,按01mL/孔加入生物素抗人FGFacidic抗體工作液,37℃反應(yīng)60min。01mol/LPBS洗滌后,加入ABC工作液（TMB空白顯色孔除外）,37℃反應(yīng)30min。洗滌后加入TMB顯色液,37℃避光反應(yīng)。30min后加入TMB終止液測定A450值。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS12.0軟件包分析所得數(shù)據(jù),比較3組細(xì)胞分泌的aFGF,P005為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、意義。2結(jié)果2.1AAV感染HT1080細(xì)胞將AAV感染AAVHT1080細(xì)胞,48h后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖1）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,GFP+細(xì)胞數(shù)約占40%。圖1AAV感染AAVHT1080細(xì)胞（48h后）2.2AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞由于AAV載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP中含有編碼綠色熒光蛋白（hrGFP）的基因序列,通過基因克隆的方法,將spaFGF基因插入到GFP基因的上游,通過熒光顯微鏡可實(shí)時(shí)觀察AAV的感染情況。用同樣滴度的AAVspaFGF和AAVGFP分別感染EPC,在感染細(xì)胞的第4天時(shí),轉(zhuǎn)導(dǎo)sp

5、aFGF基因的EPC和轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP基因的EPC均出現(xiàn)綠色熒光（圖2）。圖2AAV感染的EPC（略）2.3檢測3組EPC分泌的人aFGF蛋白轉(zhuǎn)spaFGF基因的EPC分泌的aFGF水平顯著高于轉(zhuǎn)GFP基因EPC和未轉(zhuǎn)基因EPC（862±49）ng/Lvs（115±16）ng/L,（862±49）ng/Lvs（98±10）ng/L,P005,而后兩組細(xì)胞分泌的aFGF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（115±16）ng/Lvs（98±10）ng/L,P005。3討論當(dāng)原先的血管不能提供充足的血流時(shí),側(cè)支循環(huán)成為一個(gè)重要的血液供給的來源,因此,研究促血管生長成為治療

6、缺血性心臟病的一個(gè)新方向。從動物模型到臨床試驗(yàn),對于應(yīng)用細(xì)胞生長因子治療組織缺血性疾病的研究早已開展4-6,實(shí)驗(yàn)證實(shí),在缺血心肌局部注射生長因子能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的發(fā)展7。aFGF是一種有效的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂劑,可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的激活、遷移、增殖和血管周細(xì)胞的募集的機(jī)制促進(jìn)血管生長。aFGF半衰期短,注射到體內(nèi)很快被清除和降解,而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在較長一段時(shí)期內(nèi),在組織局部維持適當(dāng)濃度的生長因子水平,達(dá)到治療效果。由于人aFGF缺少信號肽序列,不能以可溶性方式釋放到細(xì)胞外,因此,在臨床試驗(yàn)中要求對aFGF基因進(jìn)行修飾,即在aFGF基因的前端加上

7、一段編碼信號肽的基因序列,構(gòu)成分泌型aFGF基因。重組基因表達(dá)出帶有信號肽的aFGF蛋白,可分泌到細(xì)胞外,從而增強(qiáng)其促血管新生作用。本實(shí)驗(yàn)的AAV系統(tǒng)中,spaFGF基因被克隆在載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP的多克隆位點(diǎn)中,和hrGFP（人重組綠色熒光蛋白）基因由同一個(gè)轉(zhuǎn)錄子翻譯,所以hrGFP的表達(dá)可以被用作確定對目的細(xì)胞的感染效率和作為插入的目的基因的表達(dá)標(biāo)志。重組AAV感染細(xì)胞后,當(dāng)我們在倒置熒光顯微鏡下能看到綠色熒光時(shí),提示目的基因已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞中。在用AAV感染細(xì)胞的過程中,我們發(fā)現(xiàn),被同樣數(shù)量的AAV感染后,不同的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒

8、光的時(shí)間不同:293細(xì)胞被感染24h后出現(xiàn)綠色熒光;HT1080被感染48h后出現(xiàn)綠色熒光;而在EPC中,至少需要72h才能出現(xiàn)綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果反映,