引物設(shè)計原則[必看]

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1、完美WORD格式編輯mi引物設(shè)計原則1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在

2、引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearestneighbormethod)。6.ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了

3、雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。8.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴增長度大

4、一些比較好，500bp左右。要設(shè)計引物首先要找到DNA學(xué)習指導(dǎo)參考資料完美WORD格式編輯序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。③引物長度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可

5、修飾。⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。3.長度寡核苷酸引物長度為15

6、~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。4.G+C含量G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。5.堿基礎(chǔ)隨機分

7、布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。7.引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。學(xué)習指導(dǎo)參考資料完美WORD格式編輯8.引物的3′端引

8、物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。在標準PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一