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《臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中veb》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、復旦大學碩士研究生畢業(yè)論文中文摘要近年來由于抗生素在人類、動物、植物中的濫用，病原體對抗生素耐藥日趨嚴重，傳染性疾病的治療逐年變得更加有挑戰(zhàn)性，特別是由條件致病菌銅綠假單胞菌所引起的感染，它能夠迅速產(chǎn)生多重耐藥性，使多個抗生素失去了臨床效用。雖然移動元件所引起耐藥的機制一直都是我們關心的一個問題，但最困難的挑戰(zhàn)是我們?nèi)绾蚊鎸χ委煾腥具^程中銅綠假單胞菌迅速引起的耐藥。對細菌抗生素耐藥機制的研究，導致了包括轉(zhuǎn)座子和共軛質(zhì)粒在內(nèi)的許多自然移動元件的發(fā)現(xiàn)，而通過對這些元件序列進行比較分析，最終發(fā)現(xiàn)了整合子(integron)的存在【l】。整合
2、子起初在病原菌的移動性元件中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，整合子現(xiàn)在被認為是一種古老的結(jié)構并且能夠存在于不同菌種中，在如今已經(jīng)被測序鑒定的菌種中，有大約9％含有整合子?？偟膩碚f，基因盒有著非常高的多樣性，暗示著整合子．基因盒系統(tǒng)在提高大多數(shù)細菌對環(huán)境適應性上都起到很大的作用。整合子定位于革蘭陰性桿菌的染色體、轉(zhuǎn)座子或具有廣泛宿主的質(zhì)粒上，整合子是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可水平傳遞耐藥基因的DNA元件。整合子在細菌中通過位點特異性重組來捕獲基因盒，并且通過啟動子來確保這些耐藥基因的表達12J。同時整合子可謂與質(zhì)粒，或者自身周圍轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而發(fā)生轉(zhuǎn)移，
3、使耐藥基因發(fā)生播散。本研究通過對臨床多重耐藥銅綠假單胞菌整合子中的VEB．1基因盒的篩查與結(jié)構分析，并利用一種簡便的實時定量PCR的方法，來研究VEB．1基因盒的結(jié)構特點以及其中的某些結(jié)構對整合子捕獲效率的影響，從而分析解釋一些臨床耐藥性基因盒的播散現(xiàn)象。第一部分：臨床菌株中含有VEB．1型基因盒的整合子篩選VEB．1基因盒存在于整合子上，并且編碼超廣譜內(nèi)酰胺酶VEB．1(Vietnameseextended．spectrumb．1actamase)。VEB．1基因盒最初在越南臨床分離的一株大腸埃希菌株中被發(fā)現(xiàn)【3】，隨后也是在越南的
4、2株臨床分離的銅綠假單胞菌中被檢測和鑒定[441。在泰國、中國等東南亞地區(qū)的銅綠假單胞菌中也檢測到該型ESBL[鯽】。本研究選取了2004年6～11月間，華山醫(yī)院微生物實驗室經(jīng)梅里埃儀鑒定后收集并鑒定的37株全耐藥銅綠假單胞菌株，設計引物擴增其中含有VEB．1基因盒的菌株，再利用高分辨率敏感曲線HRM來分型，辨別VEB型基因盒中的VEB．1與VEB．3基因盒。設計引物擴增臨床分離VEB．1基因盒的5cs端，了解其基因環(huán)境，然后進行測序分析。最后，我們在37株全耐藥銅綠假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)有35株存在VEB型基因，說明VEB型基因盒在多重耐
5、藥細菌中分布很廣泛。經(jīng)過hrm分型，復旦大學碩士研究生畢業(yè)論文并測序確定型別后，得到9株VEB．1型基因盒。經(jīng)過PCR擴增以及測序并Blast比對之后，了解到9株細菌中有8株5cs都含有ISl999插入序列。再經(jīng)過ERICPCR鑒定后，只有3株為同一型別，其他幾株都互為不同型別。提示ISl999廣泛分布于多重耐藥銅綠假單胞菌VEB．1基因盒上游。第二部分：研究VEB．1上游ISl999結(jié)構對整合子捕獲效率的影響根據(jù)第一部分的研究結(jié)果，所有VEB．1基因盒都位于整合上，并且為第一位整合基因盒，另外有一段長lkb左右的插入序列廣泛存在于多
6、重耐藥銅綠假單胞菌中VEB-1基因盒的上游，引起了我們對此結(jié)構與整合子整合效率的興趣。有前人的研究顯示，ISl999本身編碼402氨基酸蛋白的轉(zhuǎn)座酣41，其中與ISl0有71％的氨基酸同源性，所以也屬于IS4插入序列家族。ISl999片段總共有1,328bp，有21．bp的不完全重復片段位于兩側(cè)，并且可以在轉(zhuǎn)座之后生成一個9bp的重復目標片到41，介導轉(zhuǎn)座子以及轉(zhuǎn)座片段的水平移動。本研究用長引物法構建lacZQ基因盒，并連接到載體pACYCl84質(zhì)粒中，命名為pAC．1ac。再從臨床分離銅綠假單胞菌684號菌株中擴增出含有ISl999
7、插入序列的attI位點VEB．1基因盒片段，從961號菌株中擴增出上游是普通attI位點的VEB．1基因盒片段。把這兩個片段構建進入pAC．1ac，利用相對定量PCR的方法，比較出兩者不同的基因盒捕獲頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有ISl999片段的整合子，其捕獲基因盒插入到VEB．1基因盒之前的能力與普通的整合子結(jié)構相比大大下降，由此可推測，ISl999結(jié)構可阻斷有效整合的途徑，阻止整合子捕獲其他基因盒，從而保持VEB．1在整合子的優(yōu)勢位置。第三部分：比較不同attC位點結(jié)構對VEB．1基因盒整合效率的影響I類整合子包括編碼整合酶的基因(Int
8、I)和毗鄰的一個重組位點(attI)?；蚝胁⒉皇钦献颖匾脑?，不過一旦被整合，則他們也成為了整合子的一部分，依賴在整合子上的啟動子(P。。)來表達，啟動子也是整合子5’保守區(qū)間的一部分。另外，整合子中的其他序列(比
