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《骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞與wntβ-catenin通路中β-catenin的關系分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、本課題獲得以下資助：湖南省自然基金13jj5019摘要目的擴張型心肌病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)為死亡率較高的一種疾病，目前尚未報道其有效的治療措施。近些年研究的干細胞治療技術為它帶來了新的曙光。本研究試圖通過5-aza誘導骨髓間充質干細胞分化1j擎為心肌細胞，并了解在該過程中Wnt／13．catenin信號通路是否參與分化過程的調控，旨在為臨床充分利用來源豐富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治療終末期擴張型心肌病提供有效的實驗依據。方法：從2009左右的SD雄性大鼠股骨提
2、取BMSCs，利用貼壁培養(yǎng)方法，篷培養(yǎng)至P3代細胞后利用流式細胞儀(flowcytometry，FCM)來檢測細胞的表面抗原：主要選取CD29、CD34、CD45、CDl05等四種表面抗原進行檢測，從而達到鑒定骨髓間充質干細胞的目的。臺盼藍染色計數細胞活性。選擇活性較好，純度較高的細胞制成細胞懸液，隨機均勻分成a組、b組、c組、d組，分別用O岬ol／L，5I_tmol／L，lOItmol／L，201．Lmol／L的5-aza進行干預，2周后比較總體細胞水平的活性率及心肌細胞的百分比，從而確定誘導分化的最佳濃度。此后將P3代骨髓間充質干細胞隨機分成2組，
3、即實驗組及對照組。實驗組為A組需加入最佳誘導濃度的5-aza培養(yǎng)24h誘導分化，經處理后更換為不含5-aza的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，根據培養(yǎng)時間的不同分成四組，即為培養(yǎng)第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各組細胞，分別對應為A1、A2、A3、A4四組。對照組B組不添加5-aza，參照A組的分組方法分別分為B1、B2、B3、B4四組；對各組細胞進行如下操作：①記錄不同時期細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)；②行免疫熒光檢測心肌細胞中的特異性cTnT來鑒定心肌細胞，計數心肌細胞百分比；③采用蛋白印跡法(westernblot,WB)檢測各組cTnT及p-eatenin
4、蛋白表達量，比較各組蛋白表達的變化。結果：應用FCM檢測顯示貼壁法培養(yǎng)獲取的P3代BMSCs高表達CD29、CDl05(分別為93．37％、89．08％)；而極少的表達CD34、CD45(分別為O．89％、1．06％)。經臺盼蘭試驗測定其整體活細胞百分率>95％；通過對P3代BMSCs分別加入濃度為01xmol／L，519nol／L，109mol／L，209mol／L的5-aza進行干預的a組、b組、c組、d組，2周后細胞的活性率及心肌細胞的百分率分別如下：①總細胞活性率：a組為94．2士7．4(％)，b組為93．6+7．1(％)，c組93．5+6．7
5、(％)，d組80．1+9．2(％)，將各組數據行方差分析得出，a組、b組、C組各組細胞間總細胞活性率無明顯差異，但與d組比較，P0．05，無統Ⅱ計學意義。綜合分析得出：C組即經109mol／L的5-aza處理可將BMSCs誘導分化為心肌細胞，總細胞活性率較高。由BMSC分化而來的心肌細胞經標記特異性cTnT蛋白的免疫熒光染色后，在顯微鏡下表現為染紅色熒光的細
6、胞，各組心肌細胞百分比分別為：A1組及B組所有組別細胞顯鏡下未見心肌細胞形成，百分比為0(％)；A2心肌細胞百分率為3．33+1．53(％)；A3組心肌細胞百分比為19．67+1．53(％)，A4組為25．67士2．1(％)。將所得數據行方差分析得出A2、A3、A4各組間P40．05，有統計學差異。westernblot技術檢測cTnT的表達結果，A2組(1．231+0．017)、A3組為(6．606+0．227)、A4為(8．511士0．392)明顯高于B1(O．824+0．012)、B2(0．826+0．138)、B3(O．827+0．02)、B4
7、(0．827+0．004)，A1(0．819+0．062)，A組、B組行配對t檢驗后得出，A2與B2、A3與B3、A4與B4，P<0．05，有統計學意義，A1與B1，P>0．05，無明顯差異。A1、A2、A3、A4各組行方差分析，P<0．05，各組間存在差異；B組行方差分析則未見差異。免疫熒光與westernblot檢測cTnT結果是相一致的。各組細胞p—catenin蛋白的表達結果為：B組各組細胞p．catenin蛋白的表達檢測不出。A組各組表達如下：A1(1．877+0．044)、A2(7．634+0．329)、A3(1．084+0．092)、A4
8、(O．473+0．025)，經方差分析得出各組之間差異有統計學意義。結論：1．全骨髓貼壁法培養(yǎng)
