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《galetin3誘導大鼠骨髓間充質干細胞肝樣分化過程中wntβcatenin的表達特征》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在應用文檔-天天文庫。
1、碩士學位論文氨基端結構和帶有糖識別域的羧基端參與多種生理和病理過程，包括細胞生長和凋亡、細胞粘附、免疫反應調節(jié)、新生血管形成和腫瘤浸潤與轉移等。大量研究表明Gal．3在多種細胞的再生和組織修復過程中發(fā)揮重要作用，特別是與肝細胞的再生關系密切，而確切的作用機制仍未見報道，結合我們前期實驗結果推測可能與干細胞的增殖分化有關。而BMSCs分化為肝樣細胞是一個極其復雜的過程，涉及多種細胞因子、胞內外蛋白、胞外基質等相互作用以及多個信號通路的交叉調控，目前普遍認為Wnt／13．catenin信號通路、No
2、tch信號通路、Hh信號通路、P13K／AKT信號通路、TGF—p信號通路等參與了BMSCs肝樣分化過程的調控，并發(fā)揮重要作用。其中的Wnt／13．catenin信號通路與間充質干細胞的增殖及分化密切相關，通過不同程度地調控WNT信號基因的表達，在一定條件下可以促使間充質干細胞向成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、神經細胞、肝樣細胞等分化。Wnt信號途徑廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，最常見的是Wnt／／3．catenin信號通路。該通路主要由胞外的Wnt
3、信號分子、胞膜上的受體、胞質中的一個動態(tài)降解復合體APC-Axin．GSK．3B復合物、關鍵蛋白13-catenin、下游轉錄因子Tcf兀ef等組成。在Wnt信號缺失時，胞質中的B．catenin主要被GSK-313復合體磷酸化進而被泛素化降解，從而維持胞質中13-catenin低水平狀態(tài)，通路處于關閉狀態(tài)；當Wnt信號分子與胞膜上特異性結合后可形成Wnt-Frizzled復合體結構，抑制下游GSK．3D磷酸化活性，使胞質中D．catinin積累并核內轉移激活轉錄因子發(fā)揮基因表達調控等作用。當前
4、已有研究表明，Gal．3與Wnt信號通路關系密切，其在結構和功能上與通路上的重要分子Axin、GSK一3B、13-catenin等極相似，甚至有學者指出Gal．3極有可能就是Wnt／[3．catenin信號通路上與13．catenin功能類似的重要調控因子。因此，我們推測在Gal．3誘導大鼠BMSCs定向分化為肝樣細胞過程中，經典Wnt通路可能也占據(jù)著至關重要的角色，對Gal．3誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞定向分化過程中Wnt／13．catenin信號通路表達特征的研究可對此假設進III萬方數(shù)據(jù)
5、摘要行驗證，由此為Gal．3和BMSCs在肝病的基礎研究及臨床應用提供實驗基礎。目的：探尋Gal一3誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞定向分化過程中Wnt／p．catenirl信號通路表達的相關分子影響機制，為Gal．3和干細胞移植在臨床上的應用提供基礎性研究。方法：1．SD大鼠骨髓間充質干細胞原代分離培養(yǎng)及鑒定：頸椎脫臼法處死實驗SD大鼠，收集股骨干和脛骨干中骨髓液，聯(lián)合采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法，分離出骨髓液中的骨髓間充質干細胞進行傳代培養(yǎng)；取第4代貼壁生長的細胞制備成單細胞懸液，采用流式細胞
6、術對細胞表面標志分子進行檢測鑒定，說明已成功獲得骨髓間充質干細胞。2．Gal．3誘導大鼠BMSCs肝樣分化過程中WNT信號通路重要分子表達特征的檢測：取第4代BMSCs，用預先準備好的含有0．5I．tg／mlGal一3的完全培養(yǎng)液進行誘導培養(yǎng)，每2天換液一次。實驗按照誘導不同階段分5組，分別為0d組、7d組、14d組、21d組、28d組，提取各組總RNA、總蛋白質，采用Q．PCR技術檢測Wntl、Wnt3a、GSK-313、13-catenin四個基因的mRNA水平表達情況，westernblo
7、t檢測D．catenin蛋白的表達情況，其中0d組作為參照組。3．Wnt信號通路阻滯劑和激動劑作用效果檢測：取第4代BMSCs細胞，分別加入含含有Gal．3+DKK一1、Gal．3+SB216763的完全培養(yǎng)液，體外誘導培養(yǎng)28d。分別于第0d、7d、14、21d、28d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照，然后提取總RNA、總蛋白質，采用Q．PCR檢測AFP、ALB兩個基因的表達，其中0d時間點作為參照組。westernblot檢測B．catenin、ALB兩個蛋白的表達情況。結果：分離出的S
8、D大鼠BMSCs培養(yǎng)24h后，大部分細胞已經貼壁，并呈集落狀生長，隨著培養(yǎng)時間延長，每個集落中細胞不斷分裂增殖，形態(tài)呈漩渦狀生長，萬方數(shù)據(jù)碩士學位論文外觀似成纖維樣細胞，呈長梭形，有偽足，排列有明顯的方向性，各個集落逐漸融合。流式細胞術檢測細胞表面標志分子結果顯示CD29、CD44和CD90表達陽性，造血系干細胞標記分子CD34和CD45表達不明顯，符合骨髓問充質干細胞特性。通過分別檢測Gal．3誘導大鼠BMSCs肝樣分化過程不同時段四個基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，各不同時間組的Wntl
