血細(xì)胞分離培養(yǎng)

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1、血細(xì)胞分離培養(yǎng)以前認(rèn)為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等血細(xì)胞都屬終末分化細(xì)胞，很難在體外培養(yǎng)生長或僅能短期培養(yǎng)而不能傳代，近年來由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，己有血細(xì)胞培養(yǎng)成功的報(bào)道，正常血細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長時(shí)間短，只有白血病細(xì)胞，血友病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞可培養(yǎng)成功并建立細(xì)胞系，但多半為EB病毒等致瘤病毒引起的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，（EBNA檢查陽性），二甲基亞砜（DMSO）處理也可誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為正常細(xì)胞.所建立的細(xì)胞系多半為單核細(xì)胞系、B淋巴細(xì)胞系、T淋巴細(xì)胞系，只在IL-2產(chǎn)品問世后，T細(xì)胞才可在體外建

2、系、建株.血細(xì)胞可從外周血中用梯度液通過離心分層后分離獲得.也可從脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)屮用機(jī)械法切碎過篩分離獲得淋巴細(xì)胞，從腹腔刺激后的沖洗液屮可獲得大M的單核-巨噬細(xì)胞，從骨髓中可以獲得前提血細(xì)胞，并可長期培養(yǎng)生長.加入生長因子或某些物質(zhì)有利于細(xì)胞純化并促進(jìn)分化和生長繁殖，例如在淋巴細(xì)胞中加入IL-2（TCGF），可促進(jìn)T細(xì)胞生長，建立T淋巴細(xì)胞系.在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞（B細(xì)胞）培養(yǎng)中，加B細(xì)胞生長因子，可建立B細(xì)胞系；加入IL-6（或正常淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48h的培養(yǎng)上清中的IL6）可使B細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)，建立

3、了IL-6依賴的B9細(xì)胞系.在骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)中加入二羥基維生素D3,可使單個(gè)核細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞.（一）外周血細(xì)胞分離：外周血巾除紅細(xì)胞外，還有粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及血小板等，通常是分離這些血細(xì)胞的重要來源.其分離方法有四種：A然沉降法、差異沉降法、氯化銨分離法、Ficoll分離法.1、自然沉降法：將無菌抗凝血放入試管中，在37°C水浴中靜置，自然沉降l-2h，可見到紅細(xì)胞下沉，并有明顯分層，上層血漿中富含有大量的和淋巴細(xì)胞，下層主要為紅細(xì)胞.此方法簡(jiǎn)便但各層中的細(xì)胞種類多，不純.血漿中雖

4、以粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，但也含有血小板，大單核細(xì)胞和少量紅細(xì)胞.下層雖以紅細(xì)胞為主，但也有上述各種細(xì)胞，此法適用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn).2、差異沉降法：用6%的右旋糖酐或3%的明膠溶液無菌消毒后，分裝于中試管中，由于這些物質(zhì)能使紅細(xì)胞形成“串狀”，比粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞沉降速度快，因而可使紅細(xì)胞與白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分離開.其?方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml,經(jīng)抗凝血5ml加入上層屮混合后靜賈于37°C水浴中30-60min,即可見紅細(xì)胞下沉，上層富含大量粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，下層為紅細(xì)胞，使兩者易于分離開，取上

5、層可用于粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，下層可用于紅細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，經(jīng)PBS洗3次后即可加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，可川于天然白細(xì)胞T?擾素的誘生和生產(chǎn).此法分離的細(xì)胞純度也不高.3、氯化銨分離法：0.83%鉍化銨（NH4CL）可使紅細(xì)胞破裂，通常將分離獲得的粒細(xì)胞.淋巴細(xì)胞中混有的少量的紅細(xì)胞用0.83%氯化銨進(jìn)行裂解，以排除紅細(xì)胞的干擾.另外，此法也適合大量粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的分離制備，在天然白細(xì)胞千擾素誘生和生產(chǎn)屮己被廣泛應(yīng)用.方法如下：將屮心血站供應(yīng)的健康人外周血離心分離白細(xì)胞黃層懸液先經(jīng)2000r/min離心20mi

6、n,吸出上淸血漿，將下層的紅細(xì)胞、白細(xì)胞混合后，加入0.83鉍化銨，用量為血細(xì)胞懸液液量的3倍，于4°C作用20min后離心棄去上清.在沉淀層巾再加入新鮮0.83氯化銨混勻后于4°C作用20min,以便徹底清除紅細(xì)胞，離心棄上清.收貨下層的細(xì)胞用PBS洗3次后，再用含5%人AB型血清的（含100U/mI卡拉霉素）培養(yǎng)基制成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為（8-10）xlOA9個(gè)/L，分瓶加塞在37'C普通培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（12r/h）.混懸細(xì)胞時(shí)若加入干擾素誘導(dǎo)劑（NDV-F）誘導(dǎo)22h，收貨上清就可生產(chǎn)白細(xì)胞干擾素.此

7、法分離的細(xì)胞純度更差.4、Ficoll分離法：采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴細(xì)胞分離液，通過2000r/min離心后可使血細(xì)胞以不同相對(duì)密度分離開，如分離淋巴細(xì)胞可選用相對(duì)密度1.077的分離液；若分離血小板可用相對(duì)密度1.090的分離液，若分離骨髓中的單核細(xì)胞常用相對(duì)密度1.120的分離液，現(xiàn)以淋巴細(xì)胞分離為例，方法如下.取中心血站供應(yīng)的抗凝血細(xì)胞或初步分離的白細(xì)胞黃層細(xì)胞懸液，用無鈣、鎂離子的PBS稀釋3-4倍.將Ficoll淋巴細(xì)胞分離液事先分裝于離心管中，使其沉于管底，并在37°C中預(yù)執(zhí)用吸

8、管將經(jīng)稀釋的血細(xì)胞懸液沿離心管壁緩慢加入，不讓細(xì)胞懸液沖破分層液界而，使其懸于分層液上方.以2000r/min離心20min后，不同細(xì)胞可依相對(duì)密度不同而分布于各位置上，由于紅細(xì)胞在Ficoll作用下成串下沉，故在離心管中分布在Ficoll層下方，淋巴細(xì)胞分布在Ficoll層上方.收集渾濁帶分離獲得的淋巴細(xì)胞，用無鈣、鎂離子的PBS洗3次后，再用培養(yǎng)基洗1次后計(jì)數(shù)，分瓶培養(yǎng).此法分離獲得淋巴細(xì)胞純度