血細(xì)胞分離技術(shù).doc

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1、第十八章血細(xì)胞分離技術(shù)（Separationtechniqueofthebloodcell）一、原理在體外進(jìn)行細(xì)胞免疫檢測時，首先必須進(jìn)行淋巴細(xì)胞的分離。分離淋巴細(xì)胞的方法很多，但不管采用哪種方法，均要求分離的淋巴細(xì)胞純度高、產(chǎn)量多，而且不喪失活性，同時也要求分離技術(shù)簡單、操作方便。外周血液中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的比例在幾百甚至上千比一，兩類細(xì)胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。紅細(xì)胞的自然沉降率較快，加入高分子量的聚合物，如明膠、右旋糖酐等還可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度離心法或二者結(jié)合，可以將淋巴細(xì)胞從血液中分離出來。這種分離出的淋巴細(xì)胞一般

2、包括單核細(xì)胞。除去單核細(xì)胞，可以利用單核細(xì)胞的吸附功能，如鐵顆粒、玻璃面或尼龍網(wǎng)等，除去（或分離）單核細(xì)胞，從而提純淋巴細(xì)胞。二、采血（一）材料與試劑1．抗凝劑（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，從而阻止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1000U/ml，市售肝素多為100U~126U／mg。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑。用生理鹽水配制成4％的溶液備用。（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·5H2O）0.80g枸櫞酸0.0325

3、g葡萄糖2.05g氯化鈉0.42gH2O加至100.00ml混勻溶解后，114.3℃高壓蒸汽滅菌10min備用。阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細(xì)胞生存的營養(yǎng)，所以它既可做抗凝劑，又可做血細(xì)胞的保存液。2．針頭根據(jù)不同動物和采血部位，采用不同型號的針頭，用前必須滅菌或消毒。3．采血容器注射器或三角瓶等。4．采血動物。（二）操作方法1．采血法各種動物采血方法不一。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪

4、斷眼球采血。2．抗凝采集血液最關(guān)鍵的問題是抗凝，采用什么方法進(jìn)行抗凝，則根據(jù)實驗的要求和條件而定。最常用的方法如下：（1）肝素抗凝：采血時，使每ml血液含15U~20U肝素即可。計算采集的血液量，按1000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血時，邊采血邊輕輕搖動，使抗凝劑和血液混勻。對于采少量的血液或小動物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。（2）EDTA抗凝：采血前，用滅菌生理鹽水將EDTA配制成4％溶液，然后按預(yù)采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液體量于采血容器內(nèi)。采血，并不斷搖動采血容器，使之混勻。

5、（3）玻璃珠法：預(yù)先將適量的玻璃珠（根據(jù)采血量多少而定）清洗后，裝入采血容器中，滅菌后備用。采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但對淋巴細(xì)胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，邊采邊輕輕搖動采血瓶，使之混勻。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于紅細(xì)胞的保存。一般在4℃條件下，阿氏液中保存的紅細(xì)胞2周其活性和特性不變。三、紅細(xì)胞的分離技術(shù)（一）材料與試劑1．肝素等抗凝劑2．3％明膠液取明膠3g，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中，114

6、.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存。臨用時，37℃預(yù)熱10min。3．阿氏液（二）操作方法1．采血抗凝，即為紅細(xì)胞。由于紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比例相差懸殊，一般白細(xì)胞混雜在其中，忽略不計。2．根據(jù)紅細(xì)胞的用途，可做進(jìn)一步的處理。如計算紅細(xì)胞，可直接稀釋計數(shù)。如需做補體結(jié)合反應(yīng)，或其它溶紅細(xì)胞反應(yīng)，則需將紅細(xì)胞進(jìn)行充分的清洗，以除去附著在紅細(xì)胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2000r/min離心10min，重復(fù)3~4次。3．如需儲藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。四、淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)（一）材料與試劑

7、1．淋巴細(xì)胞分層液有兩種：（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrosesolution）,商品名Ficoll，分子量400000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。應(yīng)用時，用蒸餾水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Megluminidiatrizoici)，商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60％或75％，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應(yīng)用時，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9％泛影葡胺。1.077±0.001聚蔗糖—泛影

8、葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。必要時，可測比