lacz報(bào)告基因原理

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1、為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場(chǎng)安保新項(xiàng)目的正常、順利開(kāi)展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃lacz報(bào)告基因原理　　自然界中廣泛分布著生物發(fā)光有機(jī)體，其中包括細(xì)菌、真菌、魚、昆蟲等。在這些生物發(fā)光有機(jī)體中催化生物發(fā)光反應(yīng)的各種酶都稱之為熒光素酶，底物則命名為熒光素。自1986—1987年首次被當(dāng)作報(bào)告基因使用以來(lái)，熒光素酶基因已成為目前運(yùn)用最廣泛的報(bào)告基因之一。盡管來(lái)自不同物種的熒光素酶及底物存在有很大的差異，但有一個(gè)共同點(diǎn)，即在生物發(fā)光反應(yīng)體系中均需發(fā)生氧化反應(yīng)。它通過(guò)兩個(gè)步驟使底物熒光素發(fā)生氧化作用，而產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)，此反應(yīng)是ATP依賴性的。雜環(huán)熒光素首先腺苷

2、化，然后通過(guò)氧化脫羧作用，產(chǎn)生AMP、CO2，并通過(guò)激活的熒光素中間產(chǎn)物發(fā)射光將反應(yīng)的試劑與含有熒光素酶的細(xì)胞裂解液混合即會(huì)產(chǎn)生一種迅速衰減的黃綠色閃光，這種光信號(hào)可用配備了便于迅速混合。目的-通過(guò)該培訓(xùn)員工可對(duì)保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場(chǎng)安保新項(xiàng)目的正常、順利開(kāi)展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　將反應(yīng)物的自動(dòng)注射裝置的熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，也可用標(biāo)準(zhǔn)的液閃儀對(duì)光信號(hào)進(jìn)行記錄。當(dāng)?shù)孜镞^(guò)量時(shí)，發(fā)光量的總值與樣品的熒光酶活性成正比，因此，可對(duì)熒光素酶報(bào)告基因

3、的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行間接估計(jì)。熒光素酶易被蛋白酶降解，在轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期約為3小時(shí)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)為啟動(dòng)子活性的檢測(cè)提供了一個(gè)敏感、快速、非放射性的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)步驟：1．實(shí)驗(yàn)第一天，消化并接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。2．等細(xì)胞密度達(dá)到70％時(shí)用Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒、LacZ的表達(dá)質(zhì)粒及其它質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3．轉(zhuǎn)染24－36小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會(huì)被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4．在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入350μl預(yù)冷的harvestb

4、uffer,于4oC或冰上放置10min裂解細(xì)胞。5．在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的mL微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：比例混合成反應(yīng)液后分裝，每管100μl。6．依次取等體積的細(xì)胞裂解液至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會(huì)迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5秒內(nèi)必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。8．取剩余裂解液測(cè)定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。9.用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見(jiàn)光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄?！　?bào)告基因　　定義目的-通過(guò)該培訓(xùn)員工可

5、對(duì)保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場(chǎng)安保新項(xiàng)目的正常、順利開(kāi)展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　報(bào)告基因(reportergene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。特征　　作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測(cè)方面必須具有以下幾個(gè)條件：　　(1)已被

6、克隆和全序列已測(cè)定；　　(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無(wú)背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無(wú)相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；　　(3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定?！　?yīng)用目的-通過(guò)該培訓(xùn)員工可對(duì)保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個(gè)行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場(chǎng)安保新項(xiàng)目的正常、順利開(kāi)展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個(gè)人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報(bào)告基因有以下幾種：胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因

7、、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。nos、ocs這兩個(gè)基因是致瘤土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumfaciens)的Ti質(zhì)粒特有的，對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，用相應(yīng)的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體時(shí)，如果外源基因轉(zhuǎn)入植物體中，則這兩種報(bào)告基因在植物根莖葉中均能表達(dá)，不受發(fā)育調(diào)控，檢測(cè)時(shí)直接用轉(zhuǎn)化體提取液進(jìn)行紙電泳，染色后在紫外光下觀察熒光即可。nptⅡ、cat及慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關(guān)的酶可以對(duì)底物進(jìn)行修飾(磷酸化、乙?；?，從而使這些抗生素失去對(duì)植物生