報(bào)告基因技術(shù)

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1、為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃報(bào)告基因技術(shù)　　自然界中廣泛分布著生物發(fā)光有機(jī)體，其中包括細(xì)菌、真菌、魚、昆蟲等。在這些生物發(fā)光有機(jī)體中催化生物發(fā)光反應(yīng)的各種酶都稱之為熒光素酶，底物則命名為熒光素。自1986—1987年首次被當(dāng)作報(bào)告基因使用以來，熒光素酶基因已成為目前運(yùn)用最廣泛的報(bào)告基因之一。盡管來自不同物種的熒光素酶及底物存在有很大的差異，但有一個共同點(diǎn)，即在生物發(fā)光反應(yīng)體系中均需發(fā)生氧化反應(yīng)。它通過兩個步驟使底物熒光素發(fā)生氧化作用，而產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)，此反應(yīng)是ATP依賴性的。雜環(huán)熒光素首先腺苷化，然

2、后通過氧化脫羧作用，產(chǎn)生AMP、CO2，并通過激活的熒光素中間產(chǎn)物發(fā)射光將反應(yīng)的試劑與含有熒光素酶的細(xì)胞裂解液混合即會產(chǎn)生一種迅速衰減的黃綠色閃光，這種光信號可用配備了便于迅速混合。目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　將反應(yīng)物的自動注射裝置的熒光檢測儀進(jìn)行檢測，也可用標(biāo)準(zhǔn)的液閃儀對光信號進(jìn)行記錄。當(dāng)?shù)孜镞^量時，發(fā)光量的總值與樣品的熒光酶活性成正比，因此，可對熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)

3、錄進(jìn)行間接估計(jì)。熒光素酶易被蛋白酶降解，在轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞中的半衰期約為3小時。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)為啟動子活性的檢測提供了一個敏感、快速、非放射性的檢測方法。實(shí)驗(yàn)步驟：1．實(shí)驗(yàn)第一天，消化并接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。2．等細(xì)胞密度達(dá)到70％時用Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒、LacZ的表達(dá)質(zhì)粒及其它質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3．轉(zhuǎn)染24－36小時后，吸去培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4．在每個培養(yǎng)皿中加入350μl預(yù)冷的harvestbu

4、ffer,于4oC或冰上放置10min裂解細(xì)胞。5．在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的mL微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：比例混合成反應(yīng)液后分裝，每管100μl。6．依次取等體積的細(xì)胞裂解液至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5秒內(nèi)必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。8．取剩余裂解液測定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。9.用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行業(yè)有初步了解

5、，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　熒光素酶報(bào)告基因原理：轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。　　其原理簡述如下：　　構(gòu)建一個將靶啟

6、動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。　　將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比?！　〖尤胩囟ǖ臒晒馑孛傅孜铮瑹晒馑孛概c底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用?！　〔襟E：　　1、(1)鋪細(xì)胞于24孔板中，{選用48孔板，鋪板密度約為30%。}每孔細(xì)胞數(shù)為20萬細(xì)胞左右，待細(xì)胞融匯度達(dá)到70%、85%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。一般選用細(xì)胞密度為50-7

7、0%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系的配置：目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒，luc質(zhì)粒，fermentas轉(zhuǎn)染試劑，這個比例根據(jù)細(xì)胞、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染難易程度而定，必要時需要自己摸條件）?！瞬襟E與與普通的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求相同?！　≈|(zhì)體法目的-通過該培訓(xùn)員工可對保安行業(yè)有初步了解，并感受到安保行業(yè)的發(fā)展的巨大潛力，可提升其的專業(yè)水平，并確保其在這個行業(yè)的安全感。為了適應(yīng)公司新戰(zhàn)略的發(fā)展，保障停車場安保新項(xiàng)目的正常、順利開展，特制定安保從業(yè)人員的業(yè)務(wù)技能及個人素質(zhì)的培訓(xùn)計(jì)劃　　在細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，于轉(zhuǎn)染前