玉米螟高毒力生防菌株篩選與發(fā)酵工藝研究

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1、玉米螟高毒力生防菌株篩選與發(fā)酵工藝研究　　摘要：以玉米螟（Pyraustanubilalis）為對象篩選出一株高毒力生防菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）NBIC380。通過培養(yǎng)基優(yōu)化，獲得適宜的培養(yǎng)基配方D。補料發(fā)酵研究的結(jié)果表明，固定氮源濃度為80g/L，發(fā)酵前期補料效果明顯，補料速率為根據(jù)發(fā)酵不同階段進行調(diào)整，可以取得更好的發(fā)酵結(jié)果，有利于提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本?！　￡P(guān)鍵詞：玉米螟（Pyraustanubilalis）；生防菌株；發(fā)酵　　中圖分類號：S433.4；Q813.1文獻標

2、識碼：A文章編號：0439-8114（2015）24-6248-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.039　　Abstract：AbiocontrolstrainBacillusthuringiensisNBIC380withhighvirulencetoPyraustanubilaliswasobtained.Accordingtothisstrain，appropriatemediaformulationsDwasobtainedbymediumoptimi

3、zation.Fed-batchfermentationexperimentsshowedfermentationpre-feedingeffectwasobviousbyusing80g/Lnitrogenconcentration.Feedingratewasadjustedaccordingtothedifferentstagesoffermentation.Thisstrategycouldimproveproductionandreduceproductioncosts.　　Keywords：Pyraust

4、anubilalis；biocontrolstrain；fermentation7　　玉米螟（Pyraustanubilalis）是世界性害蟲[1]，在中國各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，使用化學(xué)防治帶來的農(nóng)藥殘留危及食品安全，尤其是隨著鮮食玉米消費量的不斷上升，使得問題更是突出。20世紀60年代，國內(nèi)就開始嘗試采用Bt制劑拌土或細砂后灌心，或者使用飛機噴霧防治玉米螟低齡幼蟲[2，3]。市面上多數(shù)Bt制劑產(chǎn)品對玉米螟幼蟲都有一定的效果，但沒有以玉米螟為靶標進行篩選的專用菌種[4，5]。為此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼蟲為靶標的

5、高毒力菌株篩選體系，并開展其工程化技術(shù)研究開發(fā)[6，7]?！　?材料與方法　　1.1材料　　菌種：Bt菌種1～15號，均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心自行分離并保存，均可用于Bt產(chǎn)品生產(chǎn)。對照菌株MP-18，由湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司提供?！　」┰囅x：玉米螟采自黑龍江省，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室保種并培養(yǎng)，提供供試初孵幼蟲?！　∨囵B(yǎng)基A、B、C、D均為湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司篩選優(yōu)化的Bt生產(chǎn)用培養(yǎng)基。分批發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源濃度為25g/L，氮源濃度為55g/L，pH6.5～7.0。補料發(fā)酵培養(yǎng)基起始碳源濃度1

6、5g/L，氮源濃度80g/L，pH6.5～7.0?！　?.2方法　　1.2.1混菌法參照國家標準GB/T19567.1-2004中棉鈴蟲生物測定方法進行。7　　1.2.2分批發(fā)酵方法從斜面上接一環(huán)菌入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28℃，200r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期后期，以5%接種量接入400L種子發(fā)酵罐中，裝料240L，罐壓0.02MPa，在發(fā)酵過程中通過空氣流量及攪拌轉(zhuǎn)速對溶氧進行控制，pH不予控制。鏡檢觀察，種子長到合適的階段后，壓入5t罐繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，待晶體形成并脫落1%～5%，放罐?！　?.2.3補料發(fā)酵方法前期的補

7、料發(fā)酵在500mL三角瓶中進行。小試在20L不銹鋼自動發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵。中試在生產(chǎn)車間5000L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵。小試發(fā)酵過程中各種數(shù)據(jù)電腦監(jiān)控記錄，pH、溶氧由pH電極和溶氧電極在線檢測，攪拌轉(zhuǎn)速在100～500r/min內(nèi)無級調(diào)速，投料體積12L；培養(yǎng)基121℃滅菌30min，通氣量2m3/h?！　u瓶補料發(fā)酵：氮源一次添加，補加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30g/L，發(fā)酵12h補加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時下?lián)u床。　　20L及5000L發(fā)酵罐補料發(fā)酵：根據(jù)pH變化確定補料時機，當?shù)矸垡夯瓿伞?/p>

8、pH即將回升、有機酸等中間代謝積累物開始快速被利用時，開始補料。此時細胞對氧的需求加大，生長速度加快。補料開始時，降低培養(yǎng)溫度，由起始31℃降為28℃培養(yǎng)，降低生長速率，緩解菌體急劇生長時供氧與需氧的矛盾，延長對數(shù)期；根據(jù)溶氧確定轉(zhuǎn)速的調(diào)控，起始轉(zhuǎn)速為300r/min，當溶氧急劇下降時，將轉(zhuǎn)速調(diào)為500r/min；根據(jù)還原糖濃度確定補料速度，采