嗜水氣單胞菌asd―1基因功能研究

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1、嗜水氣單胞菌asd―1基因功能研究　　摘要：asd-1基因編碼天冬氨酸半醛脫氫酶，該酶可影響革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁正常合成。為了研究嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）asd-1基因的功能，采用OverlapPCR方法敲除該基因，結(jié)果顯示asd-1基因的敲除明顯降低了嗜水氣單胞菌的生長速度，但是不會導(dǎo)致突變株對二氨基庚二酸（DAP）的強(qiáng)制需求，進(jìn)一步對氨基酸序列分析表明asd-1蛋白質(zhì)較遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌的asdA蛋白質(zhì)多出3個氨基酸，其中Asn-257導(dǎo)致asdA蛋白質(zhì)中的關(guān)鍵活性位點(diǎn)Arg-267在asd-1蛋白質(zhì)中改

2、變?yōu)閂al-267，該研究表明嗜水氣單胞菌的asd-1基因突變顯著降低其生長速度。　　關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）；asd-1基因；生長速度；二氨基庚二酸（DAP）　　中圖分類號：S941文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2016）10-2667-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.054　　Abstract：Aspartateβ-semialdehydedeshydrogenasewhichparticipatedinthecellwallsynt

3、hesiswasedcodedbyasd-1gene.InordertorevealingthefunctionofAeromonashydrophilaasd-1gene，thisstudydeleteditbyoverlapPCRtechnology.Theresultshowedthatthebacteriagrowthratedecreasedsignificantlywhen8asd-1genedeleted，buttheobligaterequirementfordiaminopimelicacid（DAP）inasd-1mutants

4、wasnotchanged.Aminoacidsequencsalignmentfurthershowedthatasd-1proteinhad370aminoacids，buttheasdAproteinofEdwardsiellatadaandEdwardsiellaictalarijusthad367aminoacids.TheAsn-257resultedthekeysiteArg-267inasdAproteinchangedtoVal-267inasd-1protein.Itindicatedthatasd-1genemutantdec

5、reasedthegrowthrateofAeromonashydrophilasignificantly.　　Keywords：Aeromonashydrophila；asd-1gene；growthrate；diaminopimelicacid（DAP）　　嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）是一種在水樣環(huán)境中廣泛存在的細(xì)菌，該菌極易接觸動物，如魚、青蛙和人類等，到目前為止已經(jīng)從魚、食物、環(huán)境及臨床樣品中分離出該菌并且認(rèn)為該菌是魚、爬蟲動物及人類的一種重要的病原菌，該病原常引起癤瘡病、潰瘍性結(jié)腸炎和細(xì)菌性敗血癥等疾病，具有發(fā)病

6、魚種類多，流行范圍廣，多呈急性流行，發(fā)病后死亡率高的特點(diǎn)，在漁業(yè)養(yǎng)殖中由嗜水氣單胞菌引起的魚類死亡每年給全球帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時嗜水氣單胞菌也是許多魚類疾病的共感菌[1-4]?！　sd-1基因編碼天冬氨酸半醛脫氫酶（Asd；EC1.2.1.11），該酶是一種高度保守的同源二聚體酶，可將β-天冬氨酰磷酸轉(zhuǎn)換為β8-半醛天冬氨酸鹽。同時天冬氨酸半醛脫氫酶也是賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸等關(guān)鍵氨基酸生物合成的必需蛋白，同時它還在合成二氨基庚二酸（DAP）的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，而DAP是革蘭氏陰性菌及部分革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁成分肽聚糖的必需物質(zhì)[5-

7、7]。天冬氨酸半醛脫氫酶功能的缺失將導(dǎo)致細(xì)菌對DAP的強(qiáng)制性需求，否則細(xì)菌將裂解，在遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌中已經(jīng)得到證實(shí)[8-10]，但在嗜水氣單胞菌的研究中尚未見相關(guān)報道。為了揭示asd-1基因在嗜水氣單胞菌中的功能，本研究通過OverlapPCR技術(shù)敲除asd-1基因以探討該基因的功能?！　?材料與方法　　1.1試驗(yàn)材料　　試驗(yàn)所用嗜水氣單胞菌AH-1菌株來自中國科學(xué)院水生生物研究所聶品實(shí)驗(yàn)室，其他所用菌株及質(zhì)粒為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院水產(chǎn)科學(xué)研究所魚病室保存，詳見表1?！　≡囼?yàn)所用酶制劑來自TaKaRa公司，基因組提取試劑

8、盒、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購于天根生化科技有限公司，試驗(yàn)所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。　　PCR產(chǎn)物純化