hiv耐藥基因檢測平臺建立——hiv耐藥基因克隆，hiv病毒樣顆粒制備及分子檢測方法建立

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1、摘要艾滋病(Acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的傳染病，自從1981年第一例病例報道以來，全世界已有超過7000萬的人口感染了該種病毒，其中超過三分之一死于該種疾病。盡管目前已經(jīng)有很多抗艾滋病藥物應(yīng)用于臨床治療，但是這些抗病毒藥物均有耐藥株產(chǎn)生。因此，作為幫助臨床醫(yī)生選擇聯(lián)合用藥方案的重要工具，耐藥性的檢測就顯得十分重要。目前HIV耐藥檢測方法主要有表型檢測和基因型檢測。本

2、研究的目的在于建立一種敏感性高、特異性好，檢測時間短、費用低，并且能夠檢測出病毒變異混合株百分比的基因型檢測方法。該方法的建立可以使臨床醫(yī)生及時了解患者的HⅣ耐藥性，從而為HⅣ治療方案的選擇提供●有益參考。由于HIV耐藥株不易獲得，并且在實驗過程中危險性很大，對實驗室的安全性要求很高，本課題擬在體外建立HIV耐藥突變庫，從而為HⅣ耐藥檢測平臺的建立提供檢測模板。通過對HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因進(jìn)行基因克隆和定點突變，最終獲得了四個含有RT基因耐藥突變熱點的cDNA克隆。此外，本課題運(yùn)用基因克隆的

3、方法將MS2噬菌體1．7kb片斷插入pET28a表達(dá)載體中，構(gòu)建了一個新的重組表達(dá)載體。該載體可作為耐核糖核酸酶(RNase)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品制備的通用載體平臺，以促進(jìn)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的研究。實驗中將HIV病毒RT基因插入該重組表達(dá)載體中，通過誘導(dǎo)表達(dá)構(gòu)建了含有RT基因的RNA病毒樣顆粒。由于該病毒樣顆粒組成與HIV病毒相似，且無感染性，因此可以用來代替HIV耐藥株完成從病毒RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)到TaqMan實時PCR整個檢測過程，從而對所建立的HIV耐藥檢測體系進(jìn)行驗證

4、。最后本課題選擇了RT基因上的兩個耐藥突變熱點Q151M和Y181C進(jìn)行耐藥檢測方法的研究。針對這兩個耐藥位點的序列特異性，分別設(shè)計了普通型TaqMan探針和TaqMan-MGB探針，運(yùn)用TaqMan實時PCR法進(jìn)行檢測。通過對TaqMan實時PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終建立了一套能夠很好地區(qū)分耐藥突，交的TaqMan實時PCR反應(yīng)體系。與傳統(tǒng)的HIV耐藥檢測方法相比，本課題所建立的TaqMan實時PCR法具有以下優(yōu)點：1．靈敏度高、特異性好：2．檢測時間短、費用相對較低；3．可以對野生型與耐藥突變型

5、的混合樣品進(jìn)行檢測；4．可以檢測出混合樣品中的野生型與突變型各自所占的百分比：5．可以實現(xiàn)高通量檢測。該方法的建立為HIV耐藥檢測方法的研究提供了新的思路．相信通過對反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化，該方法可以應(yīng)用于更多其它HIV耐藥位點的檢測。北京工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文關(guān)鍵詞；HIV耐藥；TaqMan實對PCR；TaqMan-MGB探針；定點突變；病毒樣顆粒ⅡABSTR^(玎ABSTRACTSincethefirstrclx"toftheacquiredimmunodefieierteysyndrome(A

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