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1、版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)犛犖／犜２６６５—２０１０香蕉枯萎病菌檢疫鑒定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿犳．狊狆．犮狌犫犲狀狊犲２０１０１１０１發(fā)布２０１１０５０１實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局犛犖／犜２６６５—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售前言本標(biāo)準(zhǔn)按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳定虎、楊雷亮
2、、羅利娟、王章根、邱德義、王云華、管維。Ⅰ犛犖／犜２６６５—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售香蕉枯萎病菌檢疫鑒定方法１范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了對(duì)進(jìn)出境香蕉種苗、組培苗及其他香蕉種質(zhì)資源、商品用香蕉等中香蕉枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犮狌犫犲狀狊犲）的檢疫和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于所有進(jìn)出境香蕉種苗、組培苗及其他香蕉種質(zhì)資源、商品用香蕉等中的香蕉枯萎病菌的檢疫。２規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的
3、修改單）適用于本文件。ＳＮ／Ｔ１５３８．１培養(yǎng)基制備指南第１部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則３術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。３．１犘犇犃培養(yǎng)基犘犇犃犿犲犱犻狌犿馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，用于分離植物病原真菌。３．２犢犘犇培養(yǎng)液犢犘犇犾犻狇狌犻犱犿犲犱犻狌犿酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)香蕉枯萎病菌產(chǎn)生分生孢子。３．３厚垣孢子犮犺犾犪犿狔犱狅狊狆狅狉犲由菌絲個(gè)別細(xì)胞膨大形成，具有厚壁和濃縮的原生質(zhì)，可抵抗高溫、低溫、干旱、營(yíng)養(yǎng)短缺等不良環(huán)境條件的一種休眠孢子。４原理香蕉枯萎病又稱(chēng)香蕉巴拿馬病、黃葉病，是破壞維管束導(dǎo)致植
4、株死亡的毀滅性病害，其病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型，其英文名為ＢａｎａｎａＦｕｓａｒｉｕｍＷｉｌｔ，Ｂａｎａｎａｂａｎａｍａｄｉｓｅａｓｅ，學(xué)名為犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犆狌犫犲狀狊犲。屬于半知菌亞門(mén)（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ），絲孢綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ），瘤座孢目（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）。該病原菌的危害癥狀、菌落的形態(tài)特征、致病性測(cè)定結(jié)果和寄主范圍是鑒定該病菌的依據(jù)。５儀器設(shè)備和試劑５．１儀器設(shè)備電子天平（感量１／１００００ｇ）、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、低溫冰箱、純水器、可調(diào)微量加
5、樣器（２μＬ～１犛犖／犜２６６５—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售２００μＬ）、培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、照相機(jī)、鏟、枝剪、砍刀、紙袋、油性筆、小刀片、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、挑針、酒精燈等。５．２試劑和材料無(wú)水乙醇、７０％乙醇、瓊脂糖、瓊脂、酵母浸出粉、蛋白胨、葡萄糖、０．１％升汞、滅菌水、４０％甘油、巴西蕉、廣東香蕉２號(hào)等。培養(yǎng)基配制按ＳＮ／Ｔ１５３８．１規(guī)定。６現(xiàn)場(chǎng)檢查取樣時(shí)應(yīng)進(jìn)行針對(duì)性檢查，注意檢查有無(wú)可疑病株。若有可疑病株應(yīng)將其挑出來(lái)，并送實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步檢驗(yàn)鑒定。在以上針對(duì)性檢查基礎(chǔ)上，再按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行取樣
6、。７實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)７．１癥狀檢查受侵染的植株的癥狀參見(jiàn)附錄Ａ。７．２保濕培養(yǎng)取待檢樣品的組織切成１ｃｍ長(zhǎng)的小段，用自來(lái)水沖洗掉表面的泥土雜物后，在７５％的酒精溶液中浸泡１ｍｉｎ，經(jīng)滅菌水洗滌后，用滅菌解剖刀橫切成長(zhǎng)度為１ｍｍ～４ｍｍ的小片，放置在墊有３層滅菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿５片～１０片，轉(zhuǎn)至２５℃培養(yǎng)箱或培養(yǎng)架上培養(yǎng)，黑暗和紫外光照各１２ｈ交替，觀察植物殘?bào)w表面是否出現(xiàn)白色菌絲或霉?fàn)钗?。７．３病菌的分離培養(yǎng)從病株病健交界處切取小塊組織，采取常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離：將香蕉球莖組織切成１ｃｍ～１．５ｃｍ的方塊，先放入７０％乙醇溶
7、液中１０ｓ，再轉(zhuǎn)入０．１％升汞溶液中浸泡１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，進(jìn)行表面消毒處理，然后用滅菌水漂洗３次，于無(wú)菌濾紙上晾干，用無(wú)菌刀片除去外皮后再細(xì)切成０．３ｃｍ～０．５ｃｍ的小方塊，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，２５℃下培養(yǎng)；小苗則是將球莖切成約０．３ｃｍ的小方塊，先放于７０％乙醇溶液中浸５ｓ，再轉(zhuǎn)入０．１％升汞溶液中浸泡１５ｓ～６０ｓ進(jìn)行表面消毒處理，滅菌水漂洗３次后于無(wú)菌濾紙上晾干，置于ＰＤＡ平板上，２５℃下于ＰＤＡ培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后再對(duì)其形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行單孢分離。７．４病原菌致病性測(cè)定采用病
8、原菌孢子懸浮液接種香蕉組培苗來(lái)確定病原菌致病性。將分離、純化得到的病原菌菌株在２５℃酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)液（ＹＰＤ培養(yǎng)液參見(jiàn)附錄Ｂ）中、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)２ｄ～３ｄ，即可產(chǎn)生大量的小型分生孢子。離心去除培養(yǎng)液并用無(wú)菌水沖洗，然后配制成濃度約為１×１０６個(gè)孢子／ｍＬ的孢子懸浮液
