SNT1390-2004香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法.pdf

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1、SN中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1390-2004香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法MethodsforquarantineandidentificationofRalstoniasolanacearum(Smith)Yabuuchietalrace22004-06-01發(fā)布2004-12-01實施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局SN/T1390-2004月叨呂本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中華人民共和國廣州出人境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:張傳飛、鐘國強(qiáng)、趙立榮、司徒保祿

2、.本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出人境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。SN/T1390-2004香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出境植物檢疫中香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于香蕉、大蕉、蝎尾蕉等寄主植物之果實、吸芽、試管苗和其他繁殖材料的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定。2規(guī)茫性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款二凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GS/丁4789.28-1994食品衛(wèi)

3、牛微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑3原理香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的分類地位學(xué)名Ralstuniasulanacearum(Smith)`iabuuchietalrace2異名Pseudomonassolanacea，二二E.F.Smithrace2,病害英文名Mokodiseaseofbanana或者Aacteriaiwiltofbanana。該病菌隸屬于原核生物界Procaryotes，薄壁細(xì)菌門Gracilicutes,Ralstoniacea?？?，尺alstonia屬。香蕉細(xì)菌性枯萎病菌在寄主范圍、癥狀特點、培養(yǎng)性狀及生物學(xué)特性等方面，不同于近似種，也不同于青枯菌的其他生

4、理小種或生物型，是該病菌的鑒定依據(jù)(參見附錄八、附錄B),4儀器和試劑41儀器、器具4.1.1生物顯微鏡。4，2體視顯微鏡。413超凈工作臺。414生物培養(yǎng)箱。415高壓滅菌器。4，1.6恒溫干燥箱。4，.7電冰箱。4.1.8普通天平(感量0.01g),4.1.9試管(15mmX130mm)。4.1卜10小件用器具;培養(yǎng)皿、酒精燈、試管、載玻片、蓋玻片、接種針、接種環(huán)、移液器、白瓷盤、燒杯、記號筆、小剪刀、鑷子、刀片等。42試荊4.2.1TTC培養(yǎng)基(參見附錄C)o4.2.295%乙醇(C2H,0)。4,2.3次氯酸鈉溶液(NaC10)e42，4無菌水。aSN/T1390

5、-20045實驗室檢驗5.1癥狀檢查首先應(yīng)看植株是否萎蔫，檢查植株的根莖葉果等各個部位，葉片是否變黃、折掛，果實是否質(zhì)地變硬、顏色變褐、干腐。如果發(fā)現(xiàn)上述任何一種癥狀，應(yīng)及時用解剖刀橫向剖開病株假莖基部，檢查其維管束組織是否變褐色、病部受擠壓后是否有菌膿溢出，如果是則應(yīng)進(jìn)一步分離純化菌種。本病癥狀易與香蕉巴拿馬萎蔫病(Fusariumoxysporiumf.sp.cubensis)混淆，但前者通常是植株上部的三片幼葉先褪綠黃化，而后者往往是下部老葉先發(fā)病、病部無菌膿、為害不產(chǎn)生褐色干腐的病果.5.2細(xì)菌的分離純化5.2.1分離:采用選擇性TTC培養(yǎng)基，用平板劃線法或稀釋分

6、離法分離細(xì)菌。將病組織切成3mm見方的小塊，先用70%乙醇浸泡30s，撈出后用0.3%次氯酸鈉溶液處理5min，再用無菌水清洗兩次，最后把病組織置放在潔凈的載玻片上搗碎，靜置20s，用接種環(huán)蘸取汁液在TTC平板上劃線，350C-370C下培養(yǎng)2d--4d后，檢查并篩選培養(yǎng)基上的菌落。青枯菌在TTC上特征:無致病力或致病力很弱的菌落為深紅色，致病性菌落為流質(zhì)狀、白色或中央帶淡紅的白色。5.2.2菌種純化:采用平板劃線法，即用滅菌的移種針針頭蘸取TTC上可疑的致病性菌落后，在TTC平板上多次劃線純化，在350C-370C溫度下培養(yǎng)2d-4d，移出單個菌落后進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖。5.

7、3革蘭氏染色反應(yīng)(可省略本步驟)革蘭氏陰性反應(yīng)，按GB/T4789.28-1994中的2.2進(jìn)行實驗5，4致病性測試5.4.1測試植物測試植物除香蕉外，還應(yīng)在馬鈴薯、番茄、煙草、茄子、姜五種植物中任選兩種。香蕉枯萎病菌屬于2號小種，寄生專化性強(qiáng)，只為害香蕉不為害其他測試植物。5.4.2接種方法接種采用針刺加注射的方法，用消毒的挑針蘸上菌齡為24h、濃度為10'cfu/mL的細(xì)菌懸浮液后，針刺植株的上部幼葉或(假)莖基部。注射法采用注射器在每株植物的莖基部注射10mL左右的接種液，接種濃度10'cfu/mL。陰性對照用無菌水代替