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《htnf-α與膠原蛋白序列和mmps底物序列融合基因原核載體構(gòu)建及表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文系在導(dǎo)師指導(dǎo)下所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得廣東醫(yī)學(xué)院或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料．作者簽名：日期：羔墮2：厶!互學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明本人在就讀研究生期間所完成的學(xué)位論文及其相關(guān)成果，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬學(xué)校。本人在畢業(yè)離校前會(huì)將有關(guān)的研究資料和結(jié)果全部上交導(dǎo)師，離校后發(fā)表或使用學(xué)位論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，署名單位仍然為廣東醫(yī)學(xué)院。學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢
2、索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，可以公布(包括刊登)論文的全部或部分內(nèi)容。導(dǎo)師享有發(fā)表學(xué)位論文、申請(qǐng)成果和專利的權(quán)利。注：保密的學(xué)位論文在解密后適用本聲明。作者簽名：導(dǎo)師簽名：h腫d與膠原蛋白序列和腫s底物序列融合基因原核載體的構(gòu)建及表達(dá)ConstructionofProkaryotieVectorandExpressionofFusionGenewithTNF_a，collagenandSubstrateSqueneeofMMPs中文摘要【目的】1．采用一種全新的思路對(duì)hTNF-a(人腫癌壞死因
3、子a)進(jìn)行重組改造，探索重組hTNF-a原核細(xì)胞克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建方法，以便能同時(shí)解決hTNF-n毒副作用和腫瘤靶向性問題．2．探索重組hTNF-a融合蛋白在大腸桿菌^DE3中的表達(dá)及融合蛋白提取和純化的具體方案?！痉椒ā?．重組pMDl8·MMPI-hTNF和pMDl8-MMPS-hTNF質(zhì)粒的構(gòu)建將轉(zhuǎn)化入hTNF．a(chǎn)-pGBT9重組質(zhì)粒的DH5Ⅱ菌液劃線培養(yǎng)，然后挑取白色單菌落用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將菌液送上海生工測(cè)序部測(cè)序．挑選出測(cè)序正確的菌液進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，以此質(zhì)粒作為模板，用Prime5．0設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行P
4、CR。將PCR德到的產(chǎn)物進(jìn)行AT克隆，然后轉(zhuǎn)化并提取重組pMDl8-MMPl-hTNF和pMDl8．MMPS-hTNF質(zhì)粒．2．重組p(聊岫ona咿瑚1柵和pGEM-．collagen-MMP8-hTNF原核克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將提取的重組pMDl8-MMPI-hTNF和pMDl8·MMP8-hTNF質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶齜，和EcoRI進(jìn)行酶切，切下來的目的片段與同樣被這兩種內(nèi)切酶酶切過的pGEM-collagen重組質(zhì)粒用1"4DNALigase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a(籃自篩選)，挑取白色陽性單菌落用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行
5、培養(yǎng)，取適量菌液送上海生工測(cè)序部鍘序。3．重組pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMPS-hTNF表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建挑選測(cè)序正確的菌液培養(yǎng)并且提取pGEM-eollagen-MMPl-hTNF和pGEM-colIagen-MMP8-hTNF重組質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶Sacl和Ncol進(jìn)行酶切，然后將酶切后得到的目的片段與同樣被Sac，和NcoJ酶切過的空載pET-32a(+)Vector通過3"4DNALigase的作用進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5o(藍(lán)自
6、篩選)，挑取白色陽性單菌落用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取適量菌液送上海生工測(cè)序部測(cè)序．然后選擇測(cè)序正確的菌液培養(yǎng)并提取pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collage血-MMP8-hTNF重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入^DE3中(藍(lán)自篩選)，挑取白色陽性單菌落用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取適量菌液送上海生工測(cè)序部測(cè)序．4．融合蛋白的表達(dá)、提取與純化用IPTG(終濃度0．5retool／L)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，按Novagen公司BugBusterHis-BindPurificationKits
7、試劑盒方法進(jìn)行融合蛋白的提取和純化。用SDS-PAGE電泳初步鑒定融合蛋白是否表達(dá)以及融合蛋白的大小．【結(jié)果】1．構(gòu)建了帶有膠原酶(M^佃．1和MMP．8)底物序列和hTNF-Ⅱ突變體基因的2種克隆質(zhì)粒(重組pMDl8．MMPl-h'rNF和pMDl8一／vflVlP8-hTNF質(zhì)粒)。2．構(gòu)建了帶有膠原蛋白序列和膠原酶(MMP．1和MMP一8)底物序列的rhTNT-d的2種克隆質(zhì)粒(重組pGEM-colIagm-MMPl-hTNF和pGEM-collagen-MMPS*rhTNF質(zhì)粒)．3．構(gòu)建了帶有膠原蛋白序列和膠原酶
8、(^n仰-1和MMP-8)底物序列的rhTNF-a的2種原核表達(dá)質(zhì)粒(重組pET-32a(+)-collagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF)貢粒)．4．初步確立了重組pET-32a(+)-∞llagen-MMPl-hTNF和pET-32a(+)-co
