金屬硫蛋白在小鼠心臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用

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3、/L。分裝于玻璃試管，傾斜冷卻凝固，121℃滅菌30min；液體/發(fā)酵培養(yǎng)基：8貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2013屆碩士研究生論文成分含量蛋白胨5g/L酵母粉5g/L葡萄糖20g/LKH2PO45g/LMgSO45g/L表1-1配置液體/發(fā)酵培養(yǎng)基，充分溶解混勻后，以200ml/瓶分裝于500ml[9]錐形瓶?jī)?nèi)。121℃滅菌30min備用。成分含量蛋白胨5g/L酵母粉5g/L葡萄糖20g/LKH2PO45g/LMgSO45g/L表1-1液體/發(fā)酵培養(yǎng)基配伍表2.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程2.4.1菌種活化將保藏的菌種接種于試管斜面PDA培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)8天后，置與4℃保3存?zhèn)溆?。將活化好的菌種接入液體

4、培養(yǎng)基錐形瓶中,每瓶接0.5cm大小菌種一塊，置于25℃，150rpm搖床環(huán)境中培養(yǎng)，制備蟲(chóng)草種液。2.4.2硫酸鋅誘導(dǎo)蟲(chóng)草金屬硫蛋白9貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2013屆碩士研究生論文在液體/發(fā)酵培養(yǎng)基中按照0g/L~20g/L,梯度為1g/L，加入金屬硫蛋白誘導(dǎo)劑ZnSO4。以200ml/瓶分裝于500ml錐形瓶?jī)?nèi)。121℃滅菌30min備用。每瓶接種種液5ml，置于25℃，150rpm搖床環(huán)境中培養(yǎng),培養(yǎng)7天，并肉眼觀察菌種發(fā)酵情況。2.4.3金屬硫蛋白的粗提取將經(jīng)含ZnSO4誘導(dǎo)培養(yǎng)的的九州蟲(chóng)草菌絲體用砂型漏斗抽濾除去液體培養(yǎng)基，后用無(wú)菌去離子水沖洗3-4次，抽干得到菌絲體。將菌絲

5、體平鋪于濾紙上，置于40℃烘箱烘干菌體外水分，得到純菌絲體濕樣。收集菌絲體濕樣，稱重，按2ml/g加入0.05mol/L、pH8.2的Tris-HCl溶液，,攪拌約5min。使用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞。加入與菌絲/Tris-HCl溶液混合物體積相等的氯仿∶乙醇(0.08∶1)混合溶液,攪拌約5min以變性除去雜蛋白。9000rpm、4℃離心25min,取上清液。80℃熱變性15min，除雜蛋白后用冰水混合物迅速冷卻，靜置30min。10000rpm、4℃離心25min,取上清液,得到金屬硫蛋白的粗提液。對(duì)粗提液進(jìn)行紫外區(qū)連續(xù)掃描，210nm-320nm，間隔為0.5nm；然后

6、調(diào)PH至2，同樣在紫外區(qū)連續(xù)掃描。得到其粗提液的紫外吸收光譜特征圖。2.4.4金屬硫蛋白的精細(xì)純化使用SephadexG-50柱(4.5cm×100cm)對(duì)粗體液進(jìn)行分離,分離后用0.05mol/LTris-HCl,pH8.6緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有MT組成分的層析液，后將所得到的樣品液行254nm紫外分光光度吸收和鋅原子吸收檢測(cè)（測(cè)試條件為：波長(zhǎng)239.5nm，狹縫3mm，燈電流5mA，燈電壓170V，空氣流量0.15MPa/min，乙炔流量0.05MPa/min），繪制曲線，分析純化后的金屬硫蛋白組分。10貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2013屆碩士研究生論文將經(jīng)SephadexG-50分

7、離純化得到的金屬硫蛋白組分，收集起來(lái)并經(jīng)真空冷凍干燥儀得到其固體粉末，稱重。2.4.5金屬鋅含量的測(cè)定：菌絲體鋅含量的測(cè)定：取0.1g菌絲體濕樣加入10mL的濃硝酸/高氯酸(體積分?jǐn)?shù))為4：1的消化液，在沸水浴中加熱至澄清,用去離子水在100mL容量瓶中定容后采用原子吸收分光光度儀進(jìn)行測(cè)定。九州蟲(chóng)草金屬硫蛋白鋅含量的測(cè)定：取金屬硫蛋白凍干粉0.2mg，溶于Tris-HCl緩沖液中，采用原子吸收分光光度儀進(jìn)行測(cè)定。2.4.6巰基含量的測(cè)定：用Ellman’s方法測(cè)定巰基含量:將金屬硫蛋白凍干粉0.2mg，溶于200M