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《rna干擾對大鼠肝星狀細(xì)胞col1a1基因表達(dá)的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、·中文論著摘要·RNA干擾對大鼠肝星狀細(xì)胞COLlAl基因表達(dá)的影響目的肝纖維化(hepaticfibrosis)是肝硬化前期的病理過程，可由多種原因引起，在我國主要是乙型病毒性肝炎，酒精性肝纖維化作為其病因近年也呈上升趨勢，目前對于肝纖維化的防治尚無確切有效的手段。肝纖維化的主要病理過程是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellmatrim，ECM)沉積，而I型膠原是ECM的主要成分，正常肝臟膠原蛋白占總蛋白5—10％，其中I型膠原蛋白占總膠原蛋白的40--50％，III型膠原蛋白占總膠原蛋白的40一50％，肝纖維化時(shí)膠原蛋白可占總蛋白的50％甚至更多，其中I型膠原蛋白占總膠原蛋白的比例升至
2、60-70％，III型膠原蛋白降至20--30％?？梢姼卫w維化時(shí)主要是肝臟中I型膠原過度增加的結(jié)果。現(xiàn)已證明，肝纖維化是一種可逆的病理過程，因此本研究設(shè)計(jì)針對大鼠前I型膠原Q1鏈(COLlAl)基因的siRNA并構(gòu)建重組質(zhì)粒，同時(shí)檢測其對I型膠原蛋白表達(dá)的抑制效果，為肝纖維化的基因治療提供新的靶標(biāo)。實(shí)驗(yàn)材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料真核表達(dá)載體pGPU6／GFP／Neo、E．coliDH5a、質(zhì)粒抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI、BbsI、PstI、T4連接酶、Taq酶、Lipofectamine2000、G418、COLlAl兔多克隆抗體、13-actin兔抗人多克隆抗體、辣根過氧化物酶
3、標(biāo)記的羊抗兔二抗、大鼠肝星狀T6細(xì)胞二、實(shí)驗(yàn)方法1、篩選siRNA序列和構(gòu)建重組質(zhì)粒從NCBI網(wǎng)站獲得大鼠的COLlAleDNA序列，設(shè)計(jì)3個(gè)針對COLlAl基因不同位點(diǎn)的siRNA序列，合成雙鏈DNA(double．strandedDNA)連接到帶有U6啟動(dòng)子的pGPU6／GFP／Neo載體上，分別命名為pGPU6／OFP／Neo-shRNA-A、pGPU6／GFP／Neo—shRNA—B、pGPU6／GFP／Neo-shRNA—C。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC．T6細(xì)胞中。經(jīng)G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選，2周后選擇單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。3、檢測抑制效果
4、采用蛋白印跡(Westemblowing)方法檢測I型膠原蛋白表達(dá)情況。4、統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以i姆表示，采用SPSSl3．0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用多組單因素方差分析(ANOvA)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果l、選擇的針對COLlAl基因的siRNA序列COLIA1-A：5’-GAGTATGGAAGCGAAGGTTCC一3。．3’一CTCATACCTTCGCTTCCAAGG·5’．COLlAl．B：5’-ACAAGGTGACAGAGGCATAAA-3’，3。一TGTTCCACTGTCTCCGTATTT-5’；COLlAl．C：5’一TGATGGq'TCTCCTGGCA
5、AAGA-3’．3’一ACTACCAAGAGGACCGTTTCT-5’2、重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、Pst1分別單酶切后，陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果證實(shí)靶向COLlAlmRNA的3個(gè)重組質(zhì)粒的shRNA序列與設(shè)計(jì)的完全一致，構(gòu)建成功。3、經(jīng)Westernblowing證實(shí)重組質(zhì)粒對肝星狀細(xì)胞COLlAl蛋白的抑制率分別為26．93％44．86％、66．29％。結(jié)論成功構(gòu)建了3個(gè)針對大鼠COLlAl的質(zhì)粒載體，對I型膠原的表達(dá)都產(chǎn)生了抑制，尤以pGPU6／GFP／Neo-shRNA—C的效果明顯，從而為肝纖維化的治療提供新的途徑。關(guān)鍵詞前I型膠原a1鏈肝星狀細(xì)胞RNA干擾質(zhì)粒shRNAWe
6、sternblotting2·英文論著摘要·InhibitionofCOLIAIexpressionbyRNAinterference。thepaticstellatecellinrathepaticstellatecellobjectiveHepaticfibrosisistheearlypathologicalstatesoflivercirrhosis．Itcallbecausedbyaseriesofreasons，andinChinaitismainlycausedbyHBVhepatisis，thentheprevalenceofalcoholicfibrosishasa
7、scended．therehasn’tbeenanyexactvalidmethodtopreventit．Extracellmatrim(ECM)depositionisthemainpathologicalchangeofliverfibrosis，anditsprimaryingredientiscollagentypeI．Collagenproteinaccountsfor5to10percentoftotalproteininnormallive
