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《rna干擾技術(shù)阻斷黏著斑激酶表達(dá)對(duì)肝星狀細(xì)胞黏附和遷移的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、英文縮寫(xiě)DEPCECMEGFPFAKFRNKFCMFNGAPDHHSCs10DPAGEPMSFReal．timeQ．PCRR心RISCSDSsiRNAshRNAa．SN隊(duì)EnglishabbreviationdiethylpyrocarbonateextracellularmatrixEnhancedgreenfluorescentproteinfocaladhesionkinase眥relatednon．kinaseflowcytometryfibronectinG1yseraldehyde一3-phosphateDehydrogenaseh
2、epaticstellatecellsIntegratedopticaldensityPolyacrylamidegelelectrophoresisPhenylmethylsulfonylfluoride焦碳酸二乙酯細(xì)胞外間質(zhì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白黏著斑激酶黏著斑激酶相關(guān)非激酶流式細(xì)胞術(shù)纖維連接蛋白3．磷酸甘油醛脫氫酶肝星狀細(xì)胞累積光密度聚丙烯酰胺凝膠電泳苯甲基磺酰氟real．timequantitation實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCRRNAinterferenceRNAinducedsilencingcomplexsodiumdodecylsulf
3、ateshortinterferingRNAShorthairpinRNAa．smoothmuscleactinRNA干擾RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物十二烷基硫酸鈉小干擾RNA短發(fā)卡RNAa．平滑肌肌動(dòng)蛋白12河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾一魏稚一名搿囂囂：嘲研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫(xiě)，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名。守劣艷導(dǎo)師簽名月烏}Et中文摘要RNA干擾技術(shù)阻斷黏著斑激
4、酶表達(dá)對(duì)肝星狀細(xì)胞黏附與遷移的影響摘要肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是多種致病因子引起慢性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，如能阻斷、減輕乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，就能在很大程度上改善肝病的預(yù)后，因而這一課題也引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)活化、增殖、遷移進(jìn)而合成大量的膠原等細(xì)胞外間質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。因此，抑制HSCs活化、遷移、增殖或誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。細(xì)胞遷移是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育
5、以及組織損傷、修復(fù)和炎癥反應(yīng)必不可缺的病理生理過(guò)程，在肝組織損傷及肝纖維化形成過(guò)程中，損傷局部大量HSCs聚集可能與HSCs的定向遷移有關(guān)，在此過(guò)程中又受到一系列復(fù)雜的細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AR)是整合素信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，多項(xiàng)研究表明其在成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但對(duì)HSCs黏附、遷移的影響知之甚少。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。為此，
6、我們采用RNAi技術(shù)，從HSCs遷移入手，以FAK為切入點(diǎn)，構(gòu)建了靶向FAK的RNAi序列，在陽(yáng)離子聚合物中文摘要介導(dǎo)下將干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSCs，研究特異性阻斷FAK表達(dá)對(duì)纖維連接蛋(了(fibronectin，F(xiàn)N)束IJ激的HSCs黏附、遷移的影響及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分：第一部分：靶向FAK特異性RNA干擾重組體的構(gòu)建及篩選目的：利用pEGFP質(zhì)粒構(gòu)建靶向FAK的短發(fā)卡RNA(shRNA)：t=擾重組體，并通過(guò)轉(zhuǎn)染HSCs篩選有效的干擾序列。方法：利用在線設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)FAK的有小發(fā)卡結(jié)構(gòu)的兩條DNA序列及一對(duì)非特異
7、對(duì)照序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，再克隆至帶有U6啟動(dòng)子及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的質(zhì)粒pEGFP中，構(gòu)建重組體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a)菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后，進(jìn)行測(cè)序分析。體外培養(yǎng)HSCs，并以FN刺激HSCs增殖，在陽(yáng)離子聚合物梭華．SofastTM介導(dǎo)下，將構(gòu)建成功的3組重組體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC．T6。采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效果；通過(guò)real．timeQ．PCR技術(shù)檢測(cè)各組FAKmRNA變化，Westernblot技術(shù)檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)情況，篩選出
8、有效抑制FAK表達(dá)的序列。實(shí)驗(yàn)分6組：①空白對(duì)照組(簡(jiǎn)寫(xiě)為Con)；②FN刺激組(簡(jiǎn)寫(xiě)為FN組)；③轉(zhuǎn)染試劑組(簡(jiǎn)寫(xiě)為Sofast組)；@pEGFP．
