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《廣西巴馬小型豬活化素β2ca、β2cb亞基基因成熟肽序列的克隆與原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、廣西巴馬小型豬活化素B．、13。亞基基因成熟肽序列的克隆及原核表達(dá)摘要活化素(actIvin，ACT)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子§(TGF一13)超家族成員之一，是由兩個(gè)B亞單位通過(guò)二硫鍵相連而形成的二聚體可溶性糖蛋白，主要功能是通過(guò)活化素(activin，ACT)／抑制素(inhjbin，INH)系統(tǒng)，參與下丘腦一垂體一卵巢軸調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的發(fā)育與成熟。另外，活化素對(duì)體內(nèi)不同組織細(xì)胞如肝臟、腎臟及肌肉等還有著廣泛的調(diào)節(jié)功能。本研究參照GenBank發(fā)表的豬活化素t3．、p?；蛐蛄?，對(duì)每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，分段擴(kuò)增，然
2、后拼接。以廣西巴馬小型豬發(fā)情母豬卵巢組織總RNA為模板，通過(guò)反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出相應(yīng)的cDNA片段。擴(kuò)增片段純化后，連接到pMDl8-T載體，轉(zhuǎn)入DH5Q細(xì)菌擴(kuò)增，并測(cè)序。結(jié)果表明：擴(kuò)增得到的activ；n且．基因序列為1472bp，幾乎包含了整個(gè)編碼序列；而擴(kuò)增得到的activin13。為791bp，包含整個(gè)成熟肽及部分信號(hào)肽DNA序列。同源性比較發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬actjvin13．、B。與GenBank報(bào)道的豬activinB．、13?；蛐蛄械耐葱苑謩e達(dá)到99．8％和99．6％，與奶牛、馬及人等物種
3、activin13．、B?；蛐蛄械耐葱砸策_(dá)到了90％以上，說(shuō)明克隆得到的actjvinB．、B?；蛐蛄械恼_性。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)act；vinB．有5處發(fā)生了單個(gè)堿基的突變：即編碼序列的第391位、496位、640位、1267位及3’端調(diào)控序列上的一個(gè)堿基；activin13。有3個(gè)堿基發(fā)生了突變：即編碼序列的第599位、732位及848位。根據(jù)actiVin13．、13?；虺墒祀男蛄校謩e設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并在上下游弓l物上分別設(shè)計(jì)BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增actiVinB。、§。基因的成熟肽序列。經(jīng)BamHI和Eco
4、RI酶切分別將各個(gè)成熟肽序列定向連接到原核表達(dá)載體pRSETA質(zhì)粒上，構(gòu)建ACT-pRSETA融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)LysS。ACT-pRSETA重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定有正確的閱讀框后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ACT融合蛋自。經(jīng)SOS-PAGE和WesternBIotting分析，證明已成功地表達(dá)了actiVin13．、B?；虺墒祀男蛄械娜诤系鞍?各個(gè)片段的大小約為20KD)，此融合蛋白以包涵體的形式表達(dá)，．有較高的表達(dá)量。誘導(dǎo)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)。37"C下培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)的濃度為1mM．誘導(dǎo)5-8h有較好的效果。本研究成
5、功克隆了廣西巴馬小型豬ACT兩個(gè)亞基基因的部分cDNA序列，并構(gòu)建了重組ACT--pRSETA原核表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)lPTG誘導(dǎo)表達(dá)，為進(jìn)一步研究活化素的生物學(xué)功能及為活化素在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：廣西巴馬小型豬活化素活化素B．活化素9。融合蛋自cDNACLONING，SEQUENCEANALYSISANDPROKARYOTICEXPRESSIONOFACTIVINBA／BBMATUREPEPTIDEDNASEQUENCESFROMGUANGⅪBAMAMINI—PIGABSTRACTActivin(ACT)isoneof
6、thetransforminggrowth缸ctar-fl(TGF-msuperfamily，whichjsadimedcpolypeptidelinkedbyonedisulfidebondbetweentwomaturesubunits．Activinnotonlycanparticipateinthegrowthandmaturationofmammiferousgermcellsbyregulatingtheactiononthepituitary—oVaryintheactivin／inhibinsystem．,buta
7、lsoplaysalotsofbiologicfunctionsinuthertissuesincludingliver,kidneyandmuscle．ect．·Inordertogetactivin8AandBBgenes，twupairsofprimersforeachgeneweredesignedaccordingtheirsequencespublishedintheGeneBank．ThetotalRNAspurifiedfromGuangxiBamaMini-pigovarytissueWaSusedasthere
8、versetranscriptiontemplatesandthestrandsofwassynthesizedbyusingAMVreversetranscriptionenzyme．EachsegmentWaSamplifiedbythepol
