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《人牙本質(zhì)涎磷蛋白成熟肽cdna的克隆、序列分析和原核表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、人牙本質(zhì)涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表達關鍵詞:牙本質(zhì)涎磷蛋白;基因克隆;原核表達摘要:目的克隆人牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)成熟肽編碼區(qū)基因片段并進行原核表達.方法用異硫氰酸胍一步法從人牙乳頭組織中抽提總RNA,用Oligo(dt)作引物逆轉(zhuǎn)錄合成牙乳頭cDNA,然后利用PCR法,從cDNA中擴增出人DSPP成熟肽基因片段(約600bp),將所得基因片段插入pBluescript質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue后挑選陽性克隆,提取重組質(zhì)粒DNA,通過酶切分析和核苷酸序列分析鑒定陽性克隆;將DSPP基因重組入表達載體pG
2、EX-3X中構建表達載體,并在大腸桿菌BL21中進行表達.結果酶切圖譜和序列分析與國外文獻報道一致,DSPP蛋白在大腸桿菌中得到表達.結論克隆到人DSPP成熟肽編碼區(qū)基因片段,并在原核中得到表達,為進一步研究其功能奠定基礎. Keyandentinsailophosphoprotein;geneclone;prokaryoticexpression Abstract:AIMToclone,sequenceandprokaryoticexpresshumandentinsailophosphoprotein(DSPP).METHODSIn
3、thestudy,totalRNAthetoothgermsofalegallyabortedembryobyacidguanidiniumthiocyanata-phenol-choroformmethod,thedesiredDNAproductthetotalRNAbyRT-PCRersin-cludingOligo(dt)andters.Theseg-ment(about600bp)idedintoE.colihoststrainXL1-Blue.ThedoublestrandedDNAofthepositivecloneapping
4、andDNAsequencing.DSPPapandsequenceofhumanDSPPencodingmatureproteinanDSPPcDNAencodingmatureproteincouldbeobtainedandthushavelaidafoundationforfuturefunctionresearches. 0引言 牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentinsailophosphoprotein,DSPP)是近年發(fā)現(xiàn)的牙本質(zhì)特異蛋白,其確切功能尚不清楚,可能參與了成牙本質(zhì)細胞的分化和礦化.目前普遍認為DSPP是成牙本質(zhì)細胞分化的
5、唯一客觀指標,而且DSPP是牙本質(zhì)發(fā)育不全(dentinogenesisimperfecta,DGI)Ⅱ型的重要候選基因[1].為了深入研究DSPP的生物學功能,分析和探討成牙本質(zhì)細胞分化及牙本質(zhì)形成機制,從基因水平揭示人類牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅱ型的發(fā)病機制,用基因工程的方法表達有活性的DSPP蛋白,本實驗利用人牙胚組織,根據(jù)報道的人DSPPcDNA基因序列設計PCR引物,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法,克隆到DSPP成熟區(qū)基因片段,對其進行核苷酸序列分析,并在原核細胞中進行表達. 1材料和方法 1.1材料人牙胚的和獲取:本實驗所用人牙胚于合法引產(chǎn)人胚胎
6、.無菌條件下暴露牙齦部位,挑開牙齦組織,挖取乳切牙、乳尖牙、乳磨牙,立即置液氮中凍存,-70℃下長期保存.總RNA的提取:磨碎凍存的人牙胚組織,在盛有預冷的變性緩沖液(德國寶靈曼公司)的勻漿器中充分破碎組織細胞,組織與緩沖液的比例為110.用異硫氰酸胍一步法從牙胚組織中提取總RNA,并進行電泳鑒定. 1.2方法 1.2.1cDNA的合成和PCR擴增根據(jù)報道的人DSPP的cDNA序列,采用PCGene設計PCR擴增的兩條引物:5’端引物為GGTGTCCTGGTG-CATGAAGGT,3’端引物為CTTCGTCTTCATC-CTCATCTG,
7、由中國科學院上海細胞生物學研究所基因工程組合成.用Gibco公司的SuperScriptTM試劑盒,按其說明進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA第一鏈,以其為模板,PCR擴增出人DSPP成熟區(qū)基因片段(美國MJResearch公司PTC-150型PCR儀).TaqPlusⅡDNA聚合酶購于中科院上海生理研究所生工公司. 1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆和酶譜分析PCR產(chǎn)物用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenoega公司)補平,將載體pBluescriptKS(pBS)用EcoRⅠ酶切,然后用10gL-1瓊脂糖凝膠電泳,在長波紫外燈下切取目的片段和載體,用柱
8、式膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收PCR目的片段和載體pBS,T4DNA連接酶16℃連接過夜,制備大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,藍白