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《人牙本質(zhì)涎磷蛋白成熟肽cdna的克隆、序列分析和原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、人牙本質(zhì)涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表達關鍵詞:牙本質(zhì)涎磷蛋白;基因克隆;原核表達摘要:目的克隆人牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）成熟肽編碼區(qū)基因片段并進行原核表達.方法用異硫氰酸胍一步法從人牙乳頭組織中抽提總RNA，用Oligo（dt）作引物逆轉(zhuǎn)錄合成牙乳頭cDNA，然后利用PCR法，從cDNA中擴增出人DSPP成熟肽基因片段（約600bp），將所得基因片段插入pBluescript質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue后挑選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒DNA，通過酶切分析和核苷酸序列分析鑒定陽性克隆;將DSPP基因重組入表達載體pG
2、EX-3X中構建表達載體，并在大腸桿菌BL21中進行表達.結果酶切圖譜和序列分析與國外文獻報道一致，DSPP蛋白在大腸桿菌中得到表達.結論克隆到人DSPP成熟肽編碼區(qū)基因片段，并在原核中得到表達，為進一步研究其功能奠定基礎. Keyandentinsailophosphoprotein;geneclone;prokaryoticexpression Abstract:AIMToclone，sequenceandprokaryoticexpresshumandentinsailophosphoprotein（DSPP）.METHODSIn
3、thestudy，totalRNAthetoothgermsofalegallyabortedembryobyacidguanidiniumthiocyanata-phenol-choroformmethod，thedesiredDNAproductthetotalRNAbyRT-PCRersin-cludingOligo（dt）andters.Theseg-ment（about600bp）idedintoE.colihoststrainXL1-Blue.ThedoublestrandedDNAofthepositivecloneapping
4、andDNAsequencing.DSPPapandsequenceofhumanDSPPencodingmatureproteinanDSPPcDNAencodingmatureproteincouldbeobtainedandthushavelaidafoundationforfuturefunctionresearches. 0引言 牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentinsailophosphoprotein，DSPP）是近年發(fā)現(xiàn)的牙本質(zhì)特異蛋白，其確切功能尚不清楚，可能參與了成牙本質(zhì)細胞的分化和礦化.目前普遍認為DSPP是成牙本質(zhì)細胞分化的
5、唯一客觀指標，而且DSPP是牙本質(zhì)發(fā)育不全（dentinogenesisimperfecta，DGI）Ⅱ型的重要候選基因［1］.為了深入研究DSPP的生物學功能，分析和探討成牙本質(zhì)細胞分化及牙本質(zhì)形成機制，從基因水平揭示人類牙本質(zhì)發(fā)育不全Ⅱ型的發(fā)病機制，用基因工程的方法表達有活性的DSPP蛋白，本實驗利用人牙胚組織，根據(jù)報道的人DSPPcDNA基因序列設計PCR引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，克隆到DSPP成熟區(qū)基因片段，對其進行核苷酸序列分析，并在原核細胞中進行表達. 1材料和方法 1.1材料人牙胚的和獲取:本實驗所用人牙胚于合法引產(chǎn)人胚胎
6、.無菌條件下暴露牙齦部位，挑開牙齦組織，挖取乳切牙、乳尖牙、乳磨牙，立即置液氮中凍存，-70℃下長期保存.總RNA的提取:磨碎凍存的人牙胚組織，在盛有預冷的變性緩沖液（德國寶靈曼公司）的勻漿器中充分破碎組織細胞，組織與緩沖液的比例為110.用異硫氰酸胍一步法從牙胚組織中提取總RNA，并進行電泳鑒定. 1.2方法 1.2.1cDNA的合成和PCR擴增根據(jù)報道的人DSPP的cDNA序列，采用PCGene設計PCR擴增的兩條引物:5’端引物為GGTGTCCTGGTG-CATGAAGGT，3’端引物為CTTCGTCTTCATC-CTCATCTG，
7、由中國科學院上海細胞生物學研究所基因工程組合成.用Gibco公司的SuperScriptTM試劑盒，按其說明進行逆轉(zhuǎn)錄（RT）合成cDNA第一鏈，以其為模板，PCR擴增出人DSPP成熟區(qū)基因片段（美國MJResearch公司PTC-150型PCR儀）.TaqPlusⅡDNA聚合酶購于中科院上海生理研究所生工公司. 1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆和酶譜分析PCR產(chǎn)物用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenoega公司）補平，將載體pBluescriptKS（pBS）用EcoRⅠ酶切，然后用10gL-1瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外燈下切取目的片段和載體，用柱
8、式膠回收試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）回收PCR目的片段和載體pBS，T4DNA連接酶16℃連接過夜，制備大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，藍白
