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《金鐵鎖β-香樹素合酶cdna的克隆和原核表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、云南中醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文金鐵鎖β--香樹素合酶cDNA的克隆和原核表達姓名:劉家佳申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):中藥學(xué)指導(dǎo)教師:錢子剛2012中文摘要金鐵鎖B一香樹素合酶oDNA的克隆和原核表達研究生:劉家佳(中藥資源開發(fā)與利用)指導(dǎo)老師:錢子剛教授摘要金鐵鎖A僦嗽痂孵肋觸WC訛西C.Y冊是石竹科(Caryophyllaccae)單種屬金鐵鎖屬植物,分布于云南,貴州、四川和西藏等省,主產(chǎn)于云南西北部、中部和東北部,為國家二級保護植物,是“云南白藥”的主要組成藥材之~。長期以來,金鐵鎖完全靠野外采挖,加之自然生長緩慢,因而野生資源迅速減少,自然產(chǎn)量大幅降低。金鐵鎖資源已經(jīng)不能滿
2、足“云南白藥”等中成藥的需求。金鐵鎖的有效成分為金鐵鎖皂苷(主要是三萜皂苷)。p.香樹素合成酶(p.AS)是三萜皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶,它催化三萜類化合物的合成。針對有效部位(三萜類皂苷)生物合成途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶:金鐵鎖p.香樹素合成酶(13-AS)的cDNA的分離、原核表達和功能鑒定等進行研究,通過RT-PCR和cDNA末端快速擴增(RACE)等方法克隆其全長cDNA,結(jié)合大腸桿菌的原核表達得到目的蛋白,得到以下結(jié)果:1.提取了金鐵鎖根部總RNA,并經(jīng)R1r-PCR和RACE等方法分離得到金鐵鎖三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因:B.香樹素合成酶全長cDNA,全長28
3、82bp,ORF長2284bp,編碼760個氨基酸。2.構(gòu)建了p一香樹素合成酶基因大腸桿菌的表達系統(tǒng),通過大腸桿菌BL21(DE3)表達了p一香樹素合成酶,大小為87KD左右,與預(yù)測結(jié)果一致。以上研究為保證金鐵鎖資源的可持續(xù)利用及為金鐵鎖次生代謝工程研究奠定了重要基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:金鐵鎖三萜皂苷p-香樹素合酶克隆表達金鐵鎖e.香樹素合酶cDNA的克隆和原核表達Cloning,Expressionofp-amyrinsynthaseeDNAofPsammosilenetunicoidesW.C.WuetC.Y.Wu,andLiuJiajia(ChineseMateriaMed
4、ica)DirectedbyProfessorQianZigangPsammosilenetunicoidesW.C.WhetC.Y.Wu(Caryophyllaceae)isamonospeeificplantofthegenera.ItisdistributedinrelativelynalTOWrangesofYunnan,Guizhou,SichuanandTibet.OneofitsmaindistributionareasisfrommiddletonorthwestemYunnan.ItbelongstoSecondGradeconservationsta
5、tusanditis0neofmedicinematerialsofYunnanbaiyao,whichWasanfamoustraditionalPatentmedicine.Ithashighpharmacologicalandeconomicvalue.Foralongtime,becauseofoverdevelopmentandslowgrowth,thewildresourc定andnaturalyieldofPsammosilenetunicoideshasdeducedrapidely.It’Sresourcecannotsatisfytherequir
6、ementsforChinesepatentdrugincludingYunnanbaiyao.明1eeffectiveconstituentofPsammosilenetunicoidesistotaltriterpenesaponinsofPsammosilenetunicoidesmainlytriterpenoidsaponin。13-amyrinsynthascisthekeyenzymeinthetriterpenoidbiosynthesisroute.Itiscatalyzestheenzymaticstepinsterolandtriterpenoid
7、biosynthesis.ToguaranteethesustainableuseofPsammosilenetunicoides,inthispaper,weworkinstudyinthe舢l-lengtheDNAcloning,Expressionofp-amyrinsynthase,atritcrpenesynthasefromPsammosilenetunicoidesW.C.WhetC.Y.Wu.,玎1ispartofworkincludes:afull-lengtheDNAfragmentofPsammosilenetuni