金鐵鎖β-香樹(shù)素合酶cdna的克隆和原核表達(dá)

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1、云南中醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文金鐵鎖β--香樹(shù)素合酶cDNA的克隆和原核表達(dá)姓名：劉家佳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：中藥學(xué)指導(dǎo)教師：錢(qián)子剛2012中文摘要金鐵鎖B一香樹(shù)素合酶oDNA的克隆和原核表達(dá)研究生：劉家佳(中藥資源開(kāi)發(fā)與利用)指導(dǎo)老師：錢(qián)子剛教授摘要金鐵鎖A僦嗽痂孵肋觸WC訛西C．Y冊(cè)是石竹科(Caryophyllaccae)單種屬金鐵鎖屬植物，分布于云南，貴州、四川和西藏等省，主產(chǎn)于云南西北部、中部和東北部，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，是“云南白藥”的主要組成藥材之～。長(zhǎng)期以來(lái)，金鐵鎖完全靠野外采挖，加之自然生長(zhǎng)緩慢，因而野生資源迅速減少，自然產(chǎn)量大幅降低。金鐵鎖資源已經(jīng)不能滿

2、足“云南白藥”等中成藥的需求。金鐵鎖的有效成分為金鐵鎖皂苷(主要是三萜皂苷)。p．香樹(shù)素合成酶(p．AS)是三萜皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，它催化三萜類(lèi)化合物的合成。針對(duì)有效部位(三萜類(lèi)皂苷)生物合成途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶：金鐵鎖p．香樹(shù)素合成酶(13-AS)的cDNA的分離、原核表達(dá)和功能鑒定等進(jìn)行研究，通過(guò)RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)等方法克隆其全長(zhǎng)cDNA，結(jié)合大腸桿菌的原核表達(dá)得到目的蛋白，得到以下結(jié)果：1．提取了金鐵鎖根部總RNA，并經(jīng)R1r-PCR和RACE等方法分離得到金鐵鎖三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因：B．香樹(shù)素合成酶全長(zhǎng)cDNA，全長(zhǎng)28

3、82bp，ORF長(zhǎng)2284bp，編碼760個(gè)氨基酸。2．構(gòu)建了p一香樹(shù)素合成酶基因大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)了p一香樹(shù)素合成酶，大小為87KD左右，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。以上研究為保證金鐵鎖資源的可持續(xù)利用及為金鐵鎖次生代謝工程研究奠定了重要基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：金鐵鎖三萜皂苷p-香樹(shù)素合酶克隆表達(dá)金鐵鎖e．香樹(shù)素合酶cDNA的克隆和原核表達(dá)Cloning,Expressionofp-amyrinsynthaseeDNAofPsammosilenetunicoidesW．C．WuetC．Y．Wu，andLiuJiajia(ChineseMateriaMed

4、ica)DirectedbyProfessorQianZigangPsammosilenetunicoidesW．C．WhetC．Y．Wu(Caryophyllaceae)isamonospeeificplantofthegenera．ItisdistributedinrelativelynalTOWrangesofYunnan,Guizhou,SichuanandTibet．OneofitsmaindistributionareasisfrommiddletonorthwestemYunnan．ItbelongstoSecondGradeconservationsta

5、tusanditis0neofmedicinematerialsofYunnanbaiyao，whichWasanfamoustraditionalPatentmedicine．Ithashighpharmacologicalandeconomicvalue．Foralongtime，becauseofoverdevelopmentandslowgrowth，thewildresourc定andnaturalyieldofPsammosilenetunicoideshasdeducedrapidely．It’Sresourcecannotsatisfytherequir

6、ementsforChinesepatentdrugincludingYunnanbaiyao．明1eeffectiveconstituentofPsammosilenetunicoidesistotaltriterpenesaponinsofPsammosilenetunicoidesmainlytriterpenoidsaponin。13-amyrinsynthascisthekeyenzymeinthetriterpenoidbiosynthesisroute．Itiscatalyzestheenzymaticstepinsterolandtriterpenoid

7、biosynthesis．ToguaranteethesustainableuseofPsammosilenetunicoides，inthispaper,weworkinstudyinthe舢l-lengtheDNAcloning，Expressionofp-amyrinsynthase，atritcrpenesynthasefromPsammosilenetunicoidesW．C．WhetC．Y．Wu．，玎1ispartofworkincludes：afull-lengtheDNAfragmentofPsammosilenetuni