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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文乙肝核心抗原原核表達(dá)與純化的初步研究中文摘要目的：構(gòu)建pET28a(+)一HBcAg重組基因的原核表達(dá)載體，將重組子在E．coliRosetta(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳螯合瓊脂糖凝膠柱分離純化HBcAg蛋白，為進(jìn)一步研究其蛋白活性、試劑盒的研發(fā)以及乙型肝炎核心抗原作為載體呈遞外源表位及其疫苗的研制奠定一定的基礎(chǔ)。方法：1、pET28a(+)一HBcAg重組基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)采用PCR方法，以含HBcAg基因的克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增基因HBcAg并將其克隆入原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建成表達(dá)載體pET28a(+)一HBcAg,菌落PC
2、R、限制性內(nèi)切酶雙酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的構(gòu)建是否正確。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coliBL21和E．coliRosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，通過(guò)SDS．PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。2、以鎳瓊脂糖凝膠FF進(jìn)行全菌中HBcAg蛋白的純化將主要以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)的全菌，用Buffer溶解，超聲破碎后以鎳瓊脂糖凝膠FF純化產(chǎn)物HBcAg，通過(guò)SDS．PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析純化產(chǎn)物。結(jié)果：1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)菌落PCR、雙酶切鑒定分析以及測(cè)序結(jié)果分析表明原核表達(dá)載體pET28a(+)一HBcAg與設(shè)計(jì)相符；工程菌Rosett“DE3)／pET28(+)-HBc
3、Ag誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量為21KDa處可產(chǎn)生特異的表達(dá)條帶，并能夠被抗鼠IgG單克隆抗體所識(shí)別，蛋白分子量大小與預(yù)期相一致。2、表達(dá)細(xì)菌中的HBcAg蛋白的純化全菌蛋白經(jīng)以鎳瓊脂糖凝膠FF柱，電泳檢測(cè)HBcAg蛋白純化度，純化度約達(dá)90％；抗原性經(jīng)免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物表明，其免疫原性尚佳。結(jié)論：本課題中，我們通過(guò)基因過(guò)程的方法，成功的構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28(+)一HBcAg，鎳瓊脂糖凝膠FF柱分離純化得到了較純的HBcAg蛋白，為進(jìn)一步研究HBcAg蛋白的結(jié)構(gòu)，試劑盒的開(kāi)發(fā)及其蛋白活性及乙型肝炎核溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文心抗原作為載體呈遞外源表位及其疫苗的研制奠定一定的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞
4、：乙型肝炎；HBcAg；原核表達(dá)；包涵體2——一溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文～——————————————————————二——二二—二二二一二-～一ExpressionandPurificationofHBVCoreRecombinationProteininEscherichiacoliABSTRACTObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionvectorforHBcAgrecombinaftongene，toexpresstherecombinationgeneinE．coliRosetta(DE3)，andpurificationwithN
5、isepharoseFF，PreliminarilyevaluatethebioactivitiesofHBcAg，developmentforHBcAgkit，delivertheexogenousantigenepitoDeandforthefurtherresearchofvaccine．Methods1、ThegenefragmentofHBcAgwasamplifiedbyPCRfromplasmid,andthenwasenzymedbyEcoRIandHindIIIandwasinsertedintopET28ar+1．TherecombinantofpET28a(+)
6、一HBcAgexpressionvectorwastransformedintoE．coliRosetta(DE3)andinducedtoexpressbyIPTG．．ThepET28a(+)．HBcAgisdesignedforexpressionofrecombinantproteinfusedtothe183aminoacidthioredoxin(21kDa)，a6aminoacidHis．tag．Thefusiontagstogethercanberemovedfromtherecombinant-：targetproteinbyproteasecleavageusing
7、enterokina2、PurifiedtheHBcAgfromthewholebacteriaTheHBcAgrecombinantproteinfromthewholebacteriawaspurifiedbyNi—agarosegelFF，thepurificationnearlyupto90％．AnalysistheproductbySDS．．PAGEandWestern—Bloting．ConclusionWesuccessfullyconstr
