神經(jīng)母細(xì)胞瘤中trks基因的表達(dá)與k252a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用

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1、中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意．申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任．論文作者簽名：盔蓮日期：絲墮：￡芝中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬中國

2、醫(yī)科大學(xué)．本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱．學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：塑逢指導(dǎo)教師簽名：犀叢幻神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Trk8基因的表達(dá)及勉52a對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用前、盲神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見的腫瘤之一，它起源于神經(jīng)蜷的交感神經(jīng)鏈?；颊卟∏轭A(yù)后評判部分取決予就診時患者的年齡及其腫瘤分期。

3、NB腫瘤富有興趣的一個特征是某些嬰兒播散性胂瘤能夠在未經(jīng)治療的情況下自行消退。多數(shù)研究表明某些腫瘤標(biāo)記物可能和NB腫瘤的分期及其預(yù)后相關(guān)。目前認(rèn)為Trks原癌基因的表達(dá)在調(diào)節(jié)NB腫瘤的生物學(xué)特征方面具有重要性作用。同源性神經(jīng)營養(yǎng)素(NeⅢotmphins，NTs)家族包括神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(N’r．3)及神經(jīng)營養(yǎng)素．4／5(N隧／5)。人們近來已經(jīng)克隆出來三種酪氨酸激酶受體(Ty舶sineki-naserc叩tors，Trks)基因，即TrkA、TrkB及TrkC基因各自分別編碼NGF、BDNF及NT-3的對應(yīng)性

4、受體。NTs通過粘附和激活跨膜Trks受體激酶而發(fā)揮調(diào)節(jié)纓胞的作用。因此Trks受體激酶在調(diào)節(jié)正常和腫瘤神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長及分化中具有楣當(dāng)重要的作角。7氏ks激酶抑鍘裁作秀NB髀癯治療的探索正是基于此種假說，即NB腫瘤的細(xì)胞生長是通過NT／Trk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來維持腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。為了評估NB腫瘤中Trks基因表達(dá)的狀況及其意義，我們分別采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，對NB腫瘤組織中這些受體激酶的表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測和評價，旨在探討這些Trks基因表達(dá)和NB腫瘤的分化成熟、腫瘤分期及預(yù)后評估的關(guān)系。我們認(rèn)為普通醫(yī)院的臨床實驗室比較容易采納這些方法

5、以便開展對NB患者進(jìn)行分子和遺傳學(xué)的評價。此外，我們還研究了K252a在體外對神經(jīng)母細(xì)胞瘤sY5Y細(xì)胞的形態(tài)和生長的影響，并對其作用杌理進(jìn)行了初步性探討，為開展也52a類衍生物在NB移植模型中的抗腫瘤研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。方法一、臨床部分1、臨床資料：本組資料來源于我院自1997年至2003年已經(jīng)治療的40例患者的腫瘤組織，其中神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)34例、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GNB)2例及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤(GN)4例。全部腫瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理所證實。患者確診年齡為2月一14歲，平均年齡為3．2歲。根據(jù)Evans標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行NB的腫瘤分期，其中I期5例、Ⅱ期6例、Ⅳs期

6、3例、Ⅲ期7例及Ⅳ期13例。2、免疫組化：采用鏈霉親和素一生物素復(fù)合物(sABC)免疫組化染色技術(shù)對40例NB腫瘤組織中Trks受體激酶的表達(dá)進(jìn)行檢測。本組全部腫瘤組織統(tǒng)一進(jìn)行Trks受體免疫組化染色的半定量分級。采用0—5的六級評定分類法：O級為組織沒有染色；1級為組織微量染色；2級為偶見細(xì)胞染色；3級為細(xì)胞少量染色；4級為細(xì)胞大量染色；5級為細(xì)胞極強染色。每個切片中隨機選取10個區(qū)域，高倍鏡下觀察和評級，隨后計算這10個高倍視野區(qū)的平均分級值。3、RT．PcR：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)技術(shù)對27例NB組織中Trks基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測

7、。本組全部NB組織中Trks基因的表達(dá)，通過密度分析法測定各種靶基因產(chǎn)物與內(nèi)參照基因產(chǎn)物B—actin的比值，半定量分析這些靶基因的相對表達(dá)水平。我jf丁根據(jù)其比值差異的范圍而采用三級分類法：<0．5為不表達(dá)，O．5—1．o為低表達(dá)，>1．0為高表達(dá)。二、基礎(chǔ)部分l、細(xì)胞培養(yǎng)：人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇處理后，放置于RPMI一1640培養(yǎng)基中，在37℃含有5％C0：的飽和濕度條件下培養(yǎng)以維持細(xì)胞生長。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)對SY5Y細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將本組轉(zhuǎn)染pBPSTRl-TrkA和pBPS，rRl質(zhì)粒的細(xì)胞，分

8、別命名為S