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《在高羊茅（festuca+arundinacea+schreb.）中利用基因槍法轉(zhuǎn)化osisap1基因的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要逆境脅迫是對(duì)植物生存的一個(gè)嚴(yán)重威脅，植物面對(duì)逆境脅迫有其自身的應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)制。分子生物學(xué)的發(fā)展以及生物技術(shù)的應(yīng)用，為人們研究植物的抗逆分子機(jī)理提供了理論依據(jù)和研究方法。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與逆境脅迫相關(guān)的基因，通過基因二[程的辦法，過量表達(dá)這些基因，使轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了對(duì)逆境的抗性。高羊茅(FestucaarundinaceaSchreb．)是一種倍受青睞的優(yōu)質(zhì)草坪草，高羊茅的育種一直是人們研究的熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)旨在借助基因工程技術(shù)，轉(zhuǎn)入一個(gè)調(diào)控基因，使其在高羊茅中過量表達(dá)，以期待獲得抗逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因高羊茅植株。實(shí)驗(yàn)克隆了粳稻(Oryzas
2、alivasub．)秋光的鋅指蛋白OSISAPl基因，構(gòu)建不同標(biāo)記的兩個(gè)植物表達(dá)載體，一個(gè)載體是pGreen0229．CaMV35S．OSISAPl．DHA，DHA標(biāo)記便于免疫印跡的檢測(cè)，另一個(gè)載體是pGreen0229一CaMV35S．OSISAPl．GFP,GFP標(biāo)記可用于檢測(cè)綠色熒光，經(jīng)測(cè)序和酶切驗(yàn)證，獲得正確的植物表達(dá)載體。植物材料采用高羊茅品種交戰(zhàn)II號(hào)，實(shí)驗(yàn)建立了高羊茅下胚軸誘導(dǎo)胚性愈傷組織及其再生體系。以基因槍法轉(zhuǎn)化高羊茅胚性愈傷組織，除草劑草丁膦(2rag·L-1PPn篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織，最終獲得再生植株156個(gè)。經(jīng)PCR檢
3、測(cè)，有26個(gè)轉(zhuǎn)DHA標(biāo)記載體的陽性植株，有37個(gè)轉(zhuǎn)GFP標(biāo)記載體的陽性植株，并且葉片涂抹PPT(2mg·L1PPl)，轉(zhuǎn)基因葉片有明顯的除草劑抗性。免疫印跡雜交檢測(cè)到目的蛋白雜交條帶很微弱，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到明顯的綠色熒光，綠熒光蛋白的存在說明目的基因已經(jīng)整合到高羊茅基因組中，并在轉(zhuǎn)基囡植株中得到表達(dá)。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因高羊茅，逆境，OSISAPl，綠色熒光蛋白IIABSTRACTEnvironmentalstressisabigthreatenertoplants．Plantscommonlyhavetheirownrespondinga
4、ndregulatingsystemtodefendit．Withthedevelopmentofmolecularbiologyandbio—technology,significantprogresshasbeenmadetounderstandandmanipulateabioticstressresponses，andgeneticengineeringisthou曲ttobeusefultoimprovestresstoleranceforplants．Tallrescue(FestucaarundinaceaSchreb．)is
5、agoodlawngrassanditsbreedingresearchisahotspotallthetime．Inthisstudy,wehopetoobtainthestress—tolerantplantsbyover-expressingriceregulationgeneOSlSAPlintothetallrescue．OSlSAPlencodingazincfingerproteinwaSclonedfromjaponicarice(Oryzasalivasub．)．Twoplantexpressingvectorswerec
6、onstructedbygenerecombination．OnevectorispGreen0229一CaMV35S-OSISAPl一DHA，DHAmarkerisconvenientforwestern-blottinganalysis，theotherispGreen0229·CaMV35S-OSISAPl一GFP，GFPmarkerforgreenfluorescentobservation．ThesetwovectorswereverifiedbyDNAsequenceanalysisandenzymedigestion．Hypo
7、cotyleoftallrescue(crossfireII)isusedtoestablishtheinducionofembryoniccallianditsregenerationsystem．ThevectorsharboringOSlSAPlwereintroducedintotheembryoniccalliofhypocotylsbyparticlebombardment，and156regeneratedplantletswereobtainedbyscreeningonherbicide(PPT2mg‘L1)media．P
8、CRanalysiswasusedtoidentifytransgenicplants．Thereare26positiveplantletswithDHAmarkerand37
