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《高羊茅高頻再生體系的建立和基因槍法介導的遺傳轉化研究3b高羊茅幾丁質酶基因ⅰ保守片段的克隆及其序列分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、撼蓑高羊茅(Festucaarundinace葡，又稱葦狀羊茅，系采本科(Gramineae)羊茅屬植物，原產西歐、jb菲，窀其有抗旱、耐瘠薄，適斑性廣簿特點，在城市綠純及運動場草坪鋪設中瘟建十分廣泛。蜒出予窀連存在峙只糕糙、沒富鐲匐莖、爰拳生長緩橙、荔遺瘸瓣體幫聚草侵害等照質上的缺陷，因聰瓣要對其進杼品種潑良。邂過轉基因技術培蠢出其餐優(yōu)嶷抗逆性狀且夔觀的商羊茅晶系近年米備受人們的重視。植物j敷傳轉化的先決條件是高頻再生體系的建立，放本研究首先以高篳茅成熟種子為多}稽俸、以Ⅺs為基奉薅養(yǎng)基，研究了商羊茅箍性愈傷組緩誘導和繼代、磊生植株分純和生根等培葵
2、蒸中各級分豹簸逶配魄，建立了建叛再生體系。實驗續(xù)聚表明在鼴援gm∥L2，4固的MS培養(yǎng)旗上愈傷組織誘導頻率最蕊，初擻愈傷組織在禽育5m∥L2，4-D、400mg／LCB、609／L蔗糖和129／L瓊脂的IlS繼代培養(yǎng)基上可誘導出胚性愈傷組織和體細胞脛。在禽2．Omg／L6一BA和0．5mg／LNAA的MS培養(yǎng)基上分化形成叢生苗，分化頹率達到78．9％。再生螢在1／2lIS+NAA0．輛g／U生禳培養(yǎng)基上生撤率達100％。蕊對發(fā)現在繼棧培養(yǎng)基串將蔗糖和璩鼴濃度撮癱、{!圭及添如一定爨豹cll從露形成一個舞滲環(huán)境能明顯撼囊題性愈傷緞織的矮量和誘導頻率，十
3、分有剎于后期的分化，邀是高攀茅高頻再生體系形成的一個非常*鍵的因素。艇因槍技術蠅禾本科植物遺傳轉化的常用方法，本二c作利用PDSIOOO／He基因槍將質粒pARN6(黨隆有水稻Jh]。質酶基因gC24)鞠質粒pD(克隆有0一葡糖醛酸耱苻酶基因占坩鞠選擇標記基囂bar)導入高滲薤理觸左套豹離葦茅坯贛愈傷綴織，在分剝辯熱2。溉∥L、3。鋤∥L、5．OmgA除草裁PPT(摹l‘膦)魄分化壤葵基上黠轟戎楗辯進抒撈度薅選翻培萋，結果在附加2．Omg／L的PFI'培養(yǎng)基上愈傷組織基本上全部生長正常；在附加5。Omg／kPPT的培養(yǎng)基上。愈傷組織幾乎全部死亡{而在
4、附加3．Omg／LPPT的培養(yǎng)接上，大部分愈傷組織逐漸變?yōu)楦Ｉ劳?，少部分能正常生砼。由此可見．采?mg／L的PPT篩選濃度較為臺遙。經赭逡器生焉莢獲褥93揀秀生箍株，；{=
5、含有0．2％Tveen-20豹200m∥LPw溶液對楗株葉片進行嚷灑，最終從93撼褥生擅檬中臻選出辮株時冀始終-泰糖荽麴再生蓮，經PCR貉定初步確定為轉化植株。另外本，l：作揪據兒種采本科植物j類JkJ‘質酶氨基隧序列及其基因核箭酸序列的同I灝性比對結果設計出一對簡并引物(P1：5’-TGCCCCAACTGCCTCTGCT一3’、P2：5’-ccT餓G(T／C)TGTAGC
6、AGTC(c／G)A一3’)，通過PCR艇廊克隆了兩條高羊茅幾丁質酶基因片段。●-用0．2％氯化汞溶液處理幼嫩葉片24h，提取總RNA，同時從新鮮幼嫩葉片中提取總DNA，鼓二囊為摸教分別進行RT-PCR幫PCR反應，擴壤囂褥§《囂令長度各為849bp秘843bp的DNA贊段，分捌命名為fescue-1及fescue-2：縫六穰秘譯后推導出兩個遘續(xù)完整的氨基酸序列。分別命名為gym-pro-1及gym—pro-2。懶j懶弛i酊軟f憷行比對，發(fā)現這兩個推導出的氮基酸序列相似性達到99％，兩個核苷酸序列相似性達到97％。譙NCBI網站上進行BLAST搜索，
7、結果表明它們的核螢酸序列和氨蒸教序列分別和其它j艮本葦；}植物的I類幾丁豢薅萋因彥魏蠢蠹薹黧黲期鴦較蹇鶼露漂瞧，其中，gym—pro一1與翠熱蓉、丈麥及黑麥l類幾丁質酶的氨基酸序列相似性分別商達85％、87％和8496。同源性比對結果顯豕，兩條擴增片段在序列上具有微小差異，遮表明fescue一1與fescue-2并非來自予同一個基因，即RT-PCR中擴增產生rescue一2的mRNA勢不是PCR中擴罐產熏fescue一1麴攘裁撼A熬轉錄產凌。本王攆察簸臻萊顯示在襄蘋蒡中霹藐存在一個{類』L丁質酶多基因家族，謹們在核營酸序列和氯濺酸序列上具有高度的同源
8、性。關鍵詞：高羊茅；高頻再嫩體系：微彈轟擊{I類幾]。質酶；同=i瑪i性。羲AbstractFesmcaarundinacea，whichbelongstothefamilyGramineae，originatedinWestEuropeandNorthAfrica。Notonlydoesitpossessthecharacteristics程dmught-resistance,barrenness-toleranceandhi蚺adaptability,butalsoitcallbeusedtobeautifyurbanenvironmentand
9、coverplaygrounds．However,sinceitalsohasdisadvantagessu
